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项目名称：微生物发酵产物高效制备共性关键技术 立项背景： 微生物发酵是利用微生物作为细胞工厂、进行物质合成或生物催化与转化的过程。通过微生物发酵过程，可以实现氨基酸、蛋白质、酶制剂、核苷酸、有机酸、手性药物、香料、生物燃料等多种产品的高效生产，对于医药、化工、食品、能源等行业具有重要的作用。由于微生物发酵全社会对于生态文明的重视越来越高、监管部门对环境保护的管理力度越来越强，发酵的应用也越来越普遍，研究发酵破解制约微生物发酵水平的关键共性技术问题微生物发酵研究方法和技术手段对国民经济发展和文明建设的重要性也显著。而言，影响微生物发酵水平的关键技术问题包括：高产的高效筛选如何发酵条件强化菌株的代谢能力，如何进行发酵产品的高效分离和纯化等。这些关键共性技术不仅是微生物发酵研究的核心问题，也是生物工程的重要问题，这些技术问题重要意义价值。 项目的总体思路是代表性的发酵产物为研究模型，对发酵产品发酵过程中关键技术问题——研究，的菌株筛选模型优化方法在发酵条件研究和优化中的应用创新的发酵条件优化和开发的菌株代谢性能强化通过菌株代谢性能的强化提高发酵水平，创新高效的产物分离纯化方法，中总结用于其他发酵过程新方法、新手段和新技术微生物发酵技术的进步。 本研究选择了γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid，简称GABA)和纳豆激酶作为具体的研究对象按照思路，对它们的发酵全过程进行了全面和系统的研究。是科学家须见洋行从纳豆中发现的具有纤能力的蛋白酶，较为特异的溶解血栓中的纤维蛋白高、好、可口服等优点，在血栓相关疾病治疗和预防等方面具有广泛的应用前景。项目团队从2001年2002年开始进行的发酵，菌株筛选、发酵优化、分离纯化等关键技术环节进行了深入研究，菌株筛选模型、引入统计手段进行发酵过程研究、产物分离纯化工艺，攻克了高产菌株、发酵条件优化、产物高效提取纯化等技术问题，了创新成果。 了该方法已经成为了筛选纳豆激酶的经典方法，后续研究广泛采用 采用Plackett-Burman方法对影响发酵的各因素进行评价，用最陡爬坡路径逼近最大产酶条件区域，通过中心组合实验及响应面分析优化了发酵条件，发酵液酶活提高到1314 IU/ml，不仅显著提高了纳豆激酶的发酵水平，而且是国内最早综合应用和响应面分析发酵过程的研究之一，优化方法的，了国内发酵过程优化研究发展； 活力创造了纳豆激酶发酵产量的新记录；从未经巴氏消毒的生牛奶中分离筛选到一株产GABA的乳酸菌hjxj-01，经过UV和60Co两种诱变剂处理，通过筛选抗产物GABA突变株，得到了一株高产GABA的Lactobacillus brevis CGMCC NO.1306，该菌株发酵72hGABA产量达到17g/L 用PlackettBurman方法，得到最佳培养基组成和初始，GABA的发酵产量达到33.42g/L基础上，3升发酵罐中溶氧和pH控制谷氨酸转化为GABA和GABA转化琥珀酸代谢流量补料发酵小时产量达到g/L，发酵小时后产量达到107.5 g/L1）500升发酵罐上进行了GABA发酵中试研究和pH值，使72h时GABA产量达到40.1 g/L（图2） 图1 GABA分批补料发酵过程中生物量、葡萄糖、谷氨酸和GABA变化（3升发酵罐）图2 500升发酵罐中GABA的发酵进程曲线 对发酵液中GABA的后提取方法和工艺进行了研究，设计了独创性的壳聚糖絮凝→大孔树脂吸附脱色→离子交换层析→结晶精制的GABA分离纯化工艺，实现了高纯度GABA（＞98％）（图3）弥补了中纯化和工艺的缺失，为其他类发酵产物的研究了新的 图3 结晶获得的（）了独创性的与与米根霉乳酸发酵耦合制备 GABA和乳酸新工艺，利用乳酸发酵的H+发酵液的pH值控制，领用 GABA对H+消耗来解除乳酸发酵中的酸抑制，2种发酵过程的互补和自动平衡，实现了GABA和乳酸的高效、经济制备Glu 到 GABA 的摩尔转化率 96.5%，乳酸的产量达到 80.2 g/L） 与当前国内外同类技术主要参数、效益、市场竞争力的比较： 与国内外纳豆激酶和研究相比，本项目由于了新的菌株筛选、了优化手段、识别出了影响发酵水平的关键要素，无论是菌株的生产性能、还是最终的产物发酵水平，都远超过已有成果水平，在国内外均处于领先地位1）。 表GABA发酵研究的发酵水平 菌种来源 GABA产量 Lactobacillus brevis CGMCC NO.1306研究Milk 78 g/L Lb. brevis NCL912 Paocai 35.66 g/L Lb. paracasei NFRI 7415 Fermented crucians 31.14 g/L Lb. brevis GABA 057 NR 23.41 g/L Lb.