实验六肝微粒体的制备及细胞色素P-450含量测定.doc

院系：理学院 专业：农药学 学号：09310110020 姓名：王熠 肝微粒体的制备及细胞色素P-450含量测定 1 实验目的 本实验通过超速离心法制备肝微粒体，利用Bradford法，学习并掌握了细胞色素P-450含量的测定。 2 实验原理 研究体外药物代谢常用的方法是制备肝微粒体或线粒体后部分，将肝组织制备成20％匀浆，按1g肝组织加0.25mol/L蔗糖溶液或pH7.4 Tris-HCl缓冲液3mL ，磨成匀浆，用低温高速离心制备线粒体后上清液和超速离心法制备微粒体（内质网部分）-差速离心法。 细胞色素P-450是微粒体混合功能氧化酶中最主要的功能成分，其含量的高低基本可以反映混合功能氧化酶的活力大小。细胞色素P-450是一种血红蛋白，当铁蛋白的铁离子被还原并与一氧化碳形成复合物时出现一种特异吸收峰，在波长450nm处呈现最大吸收峰，在490nm处为最低吸收。根据两者的差值和吸收系数，可定量细胞色素P-450含量。 3 实验材料 3.1实验动物 大鼠：健康，体重200～250g，禁食过夜（24h） 3.2实验器材与试剂 器材：低温高速离心机、洁净工作台、匀浆器、注射器、手术剪、低温冰箱、液氮罐等 试剂：1.17% KCl 溶液 Tris-HCl缓冲液： Tris 6.05 g ；蔗糖 68.4 g； 水 500 ml；浓盐酸调 pH 7.4；补水 至 1000 ml 4.实验方法 4.1动物处理与匀浆制备 断头处死，放尽血液，迅速剖开胸、腹腔，取出肝脏，用冰冷1.17% KCl 溶液洗净血污，并用滤纸吸干表面水分。肝脏称重，置烧杯中剪碎，按每克肝脏3ml的比例加入0.25mol/L蔗糖溶液或pH7.4 Tris-HCl缓冲液，匀浆，将匀浆倒入离心管中，用缓冲液洗涤匀浆管，使最后的缓冲液体积加至约20％（W/V）的匀浆。 4.2制备线粒体后上清液 将肝匀浆置低温高速离心，以沉淀未破碎的细胞、细胞碎片、核及线粒体，上清液即为线粒体后上清液。温度为0～4℃；离心力10 000～12 500g；时间 15～30min 4.3制备微粒体-超速离心法 取线粒体后上清液8～12mL，置超离心管；离心 100 000g 60min，弃上清液；微粒体板用0.25mol/L蔗糖液或1.17％KCl液洗1次，以除去污染的血红蛋白再离心 100 000g 30～60min，弃上清液；微粒体板沉淀物移至离心管，加适量pH 7.4 Tris-HCl缓冲液重悬，终产物为微粒体悬液制备的肝微粒体每1g含蛋白一般在20mg左右；最好当天使用。若保存，应加20％（V/V）甘油分装于塑料管，置-20~-80℃，可保存数周而酶活性不减。 4.4微粒体蛋白浓度测定 1.微量法制定标准曲线 取8个1.5ml离心管，分别编号0-7，按下表配制浓度梯度标准蛋白溶液。浓度梯度标准蛋白溶液样品编号 0 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋白溶液((L) 0 25 50 100 200 300 400 500 Tris-HCl缓冲液((L) 1000 975 950 900 800 700 600 500 标准蛋白浓度（mg/ml） 0 0.025 0.050 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 考马斯亮蓝试剂((L) 200 取上述各浓度蛋白标准稀释液20(L 与考马斯亮蓝染色剂200(L至96孔酶标板内，各设三个重复孔，混匀，室温静置5-10min，以0号试管为空白对照，于595nm处比色测定各孔OD值。以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。 2.未知样品蛋白质浓度的测定 测定方法同上，分别取肝微粒体悬液100倍和200倍稀释液20(L，测定OD595nm值，平行测定三次。根据所测定的平均OD595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。 取蛋白含量已知的组织样品用pH7.4 0.1mol/L Tris缓冲液(1.21g Tris加约80ml蒸馏水溶解，用HCl溶液调pH值至7.4，最后用蒸馏水定容至100ml稀释为每1mL含 10mg微粒体蛋白的悬液；取此液0.3mL，加上述缓冲液5.7mL，混合；分装于2个比色杯（大约3mL），一个作为样品杯，另一个作为参比杯，置双光束紫外分光光度计，扫描400和500nm间的基线；加数mg连二亚硫酸钠，搅拌，样品杯轻轻充CO约1min，再扫描400～500nm的差示光谱。 4.6结果计算 P-450含量＝△OD（450-490）×1000/ 91×蛋白浓度C × r （mg/ml）×稀释倍数 （ nmol/mgPr） ΔOD为450n