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实验四PCR和电泳技术
实验4 PCR及电泳技术;1. PCR的基本原理;PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95℃);引物酶;PCR Cycle - Step 3 - At 72 ℃ Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated;End of the 1st PCR Cycle –Results in two copies of target sequence;Target Amplification;PCR仪;PCR仪;PCR仪;1、PCR反应成分;2）引物
（1）浓度 0.1-0.5 ?M
浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。;3）Taq DNA聚合酶
一般0.5-2.5 U/50?l；
酶量过少影响反应产量；浓度过高可引起会造成杂带、特异产物带不清晰等不好的结果，浓度过低则得不到所需的产物。最可靠的做法是先做浓度对照,再根据结果决定最佳条件。;4）dNTP (dATP、dCTP、dGTP、dTTP 4）
dNTP浓度取决于扩增片段的长度;
四种dNTP浓度应相等;
PCR常用的浓度为50-200μM，不能低于10-15μM。
浓度过高会抑制Taq 酶的活性，易产生错误碱基的
掺入，浓??过低则降低反应产量;5）10×PCR缓冲液 (Mg2+)：
500 mM KCl，
100 mM Tris-HCl (pH 8.4)，
150 mM MgCl2 ，
1 mg/ml明胶。;PCR反应体系：
10×PCR buffer 2.5μl
dNTP mix 各0.5μl
引物1 0.5 μl
引物2 0.5 μl
DNA模板 2 μl
Taq 酶 0.5 μl
加双蒸水至总体积为25μl;PCR扩增程序:;2. 电泳技术;电泳分离的原理;电泳技术的种类;琼脂糖凝胶电泳;1、熔化琼脂糖时，宜低火，防暴沸；
2、倒胶时温度要低于60℃且速度要慢；
3、拔梳子和点样要小心，以免破坏胶孔；
4、电泳仪打开前应检查电压、电流旋纽是否处于零位置，工作电压一般为60-80V，400mA，电泳完毕应将电压、电流旋钮恢复到零位置；
5、防止EB污染和紫外灯伤眼。;琼脂糖浓度（％）; M P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 CK
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