实验2.特殊显微镜及其使用.pptVIP

实验2 特殊显微镜及其使用 暗视野显微镜 相差显微镜 （一）暗视野显微镜 暗视野显微镜（dark field microscope）的聚光镜中央有遮光片，使得照明光线不能直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的，利用这种显微镜能见到小至 4-200nm的微小粒子。 一、实验目的 1.学习暗视野显微镜的原理、了解其构造 2.练习暗视野显微镜的使用 二、实验原理 1.暗视野显微镜设计原理 暗视野显微镜的设计应用了丁达尔现象（Tyndall phenomenon: 在光的传播过程中，光线照射到粒子时，如果粒子大于入射光波长很多倍，则发生光的反射；如果粒子小于入射光波长，则发生光的散射，这时观察到的是光波环绕微粒而向其四周放射的光，称为散射光。从光束的侧面可以看到一条发亮的光柱，丁达尔效应就是光的散射现象）。 二、实验原理 通过特殊的聚光器——暗视野聚光器。由于聚光器的特殊构造，入射光线在聚光器顶透镜或盖片的上表面发生全反射，不能入射物镜之内，所以显微镜视野是暗的；但是，装片上的样品被入射光斜向照明，并发出散射光。这些被标本散射的光可以进入物镜，通过目镜被我们检测到。镜检时，因不能直接观察到照明光线，与光轴垂直的平面视场暗黑，在深暗的背景上能清晰地看到由散射光和反射光形成的明亮的物体影像，物像与背景造成极大的反差，使样品更明显。视场内的样品，被斜射光线照明，可从样品各种结构表面散射和反射光线，看到许多细胞器的明亮轮廓，诸如细胞核、线粒体、液泡以及某些内含物等，能够观察到4-200nm之间的微粒子的存在和运动，但不能看清其内部结构。 二、实验原理 2.暗视野显微镜的特殊构造 图2-1 抛物面聚光器及其光路 入射光发生全反射，样品被照明并射出反射光，散射光进入物镜。 二、实验原理 3.暗视野显微镜的光路 二、实验原理 4.自己动手制作暗视野显微镜 暗视野光挡 (左：金属片或厚卡纸制成; 右：透明滤色镜贴黑纸制成) 二、实验原理 5. 暗视野光挡加放的位置及其调整 将制作的暗视野光挡粘贴在滤色镜中央部位并加放在聚光器下的滤色镜支架上，使光挡的中心准确地位于显微镜光轴的轴心部位。否则，因暗视野光挡中心偏移，使部分入射光进入物镜之内，破坏暗视野的效果。 镜检观察时．如果视场中样品与背景的明暗反差不强时，除光挡的中心位置不正外，也可能是光挡的直径大小不合适，可通过聚光器升降螺旋上下调节聚光器，使光挡影像恰好与物镜的孔径相当，使视场内的反差提高。 三、实验用品 1.材料：口腔黏膜上皮细胞、洋葱内表皮细胞 2.试剂：生理盐水、蒸馏水 3.器材和仪器：载玻片、盖玻片、显微镜、擦镜纸等 四、实验内容 1、口腔黏膜上皮细胞和洋葱内表皮细胞装片制作 2、用暗视野显微镜观察样品 五、作 业 绘制暗视野内的口腔黏膜上皮细胞和洋葱内表皮细胞图（3-5个细胞）。 （二）相差显微镜 相差显微镜（phasecontrast microscope）由荷兰物理学家泽尔尼克(Frits Zernike ,1898-1966),于1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜特别适用于观察具有很高透明度的对象，例如生物切片、油膜和位相光栅等等。光波通过这些物体，往往只改变入射光波的位相而不改变入射光波的振幅，由于人眼及所有能量检测器只能辨别光波强度上的差别，也即振幅上的差别，而不能辨别位相的变化，因此用普通的显微镜是难以观察到这些物体的。而相差显微镜能够将透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见，所以能够用来观察未经染色的标本和活细胞。 一、实验目的 1.学习相差显微镜的原理、了解其构造 2.练习相差显微镜的使用 二、实验原理 1. 相差显微镜设计原理 活的细胞或未经染色的标本多为无色透明的，照明光线通过时，透射光或反射光的波长和振幅都不发生改变，而人的眼睛只能感觉到光线的波长（颜色）和振幅（亮度）的变化，所以用普通光学显微镜难以看清活细胞或未经染色标本的结构。但是，即便是接近透明的细胞或标本，各部分的厚度也会有微小的差异，折射率也不同。因此，光线通过时在各部分的滞留时间就会不同，即光程不同，所以就会产生相差（相差是指同一光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。相位是指在某一时间上，光的波动所达到的位置）。 二、实验原理 1. 相差显微镜设计原理 但这样所能产生的相差太小，我们的眼睛是很难分辨出这种差别的。只有在变相差为振幅差（亮度差）之后，才能被分辨。 相差显微镜就是利用光的衍射和干涉原理设计的，它能够