生物重组工程作业.docVIP

生物重组工程 一、概述 基因重组是由于不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合，从而形成新DNA分子的过程。发生在生物体体内基因间的交换或重新组合，包括同源重组、位点特异重组、转座作用和异常重组四大类，是生物遗传变异的一种机制。在生物体体外，重新组合脱氧核糖核酸分子，并使它们在适当的细胞中增殖的遗传操作，称之为重组DNA技术（recombinant DNA technique），即遗传工程。这种操作可把特定的基因组合到载体上，并使之在受体细胞中增殖和表达，因此它不受亲缘关系限制，为遗传育种和分子遗传学研究开辟了崭新的途径。 基因重组是指非等位基因间的重新组合，能产生大量的变异类型，但只产生新的基因型，不产生新的基因。基因重组的细胞学基础是性原细胞的减数分裂第一次分裂，同源染色体彼此分裂的时候，非同源染色体之间的自由组合和同源染色体的染色单体之间的交叉互换，基因重组是杂交育种的理论基础。基因突变是指基因的分子结构的改变，即基因中的脱氧核苷酸的排列顺序发生了改变，从而导致遗传信息的改变。 广义的遗传工程包括细胞水平上的遗传操作（细胞工程）和分子水平上的遗传操作，即重组DNA技术（recombinant DNA technique），狭义的遗传工程则专指后者。 1980年Hobom B.采用合成生物学（synthetic biology）的概念来表述基因重组技术。随着基因组计划的成功，系统生物学突现为前沿，2000年Kool E.重新定义合成生物学为基于系统生物学的遗传工程，从而DNA重组技术与转基因生物技术发展到了人工设计与合成全基因序列、基因调控网络，乃至基因组的一个新的历史时期。 二、步骤和技术路线? 重组DNA技术一般包括五个步骤：①获得目的基因；②与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；③用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中进行复制和遗传；④对转化子进行筛选和鉴定，并从具体工作中选择合适的技术路线；⑤对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物，主要取决于基因的来源、基因本身的性质和该项遗传工程的目的。 1、重组DNA片段的取得 主要的方法有：①利用限制酶取得具有粘性末端或平整末端的DNA片段；②用机械方法剪切取得具有平整末端的DNA片段，例如用超声波断裂双链DNA分子；③经反向转录酶的作用从mRNA获得与mRNA顺序互补的DNA单链，然后再复制形成双链DNA（cDNA）。例如人的胰岛素和血红蛋白的结构基因都用这方法获得。这样获得的基因具有编码蛋白质的全部核苷酸顺序，但往往与原来位置在染色体上的基因在结构上有区别，它们不含称为内含子的不编码蛋白质的间隔顺序；④用化学方法合成DNA片段，从蛋白质肽链的氨基酸顺序可以知道它的遗传密码，依照这密码用化学方法可以人工合成基因。 2、DNA片段和载体的连接 DNA片段和载体相连接的方法主要有四种：①粘性末端连接，每一种限制性核酸内切酶作用于DNA分子上的特定的识别顺序，许多酶作用的结果产生具有粘性末端的两个DNA片段。例如来自大肠杆菌（Escherichia coli）的限制酶EcoRI作用于识别顺序↓…GAATTC… …CTTAAG…↑（↑指示切点），产生具有粘性末端…G …CTTAA和AATTC… G…的片段。把所要克隆的DNA和载体DNA用同一种限制酶处理后再经DNA连接酶处理，就可以把它们连接起来。②平整末端连接，某些限制性内切酶作用的结果产生不含粘性末端的平整末端。例如来自副流感嗜血杆菌（Hemophilus parainfluenzae）的限制酶Hpal作用于识别顺序↓…GTTAAC… …CAATTG…而产生末端为…GTT …GAA的DNA片段。用机械剪切方法取得的DNA片段的末端也是平整的。在某些连接酶（例如感染噬菌体T4后的大肠杆菌所产生的DNA连接酶）的作用下同样可以把两个这样的DNA片段连接起来。③同聚末端连接，在脱氧核苷酸转移酶（也称末端转移酶）的作用下可以在DNA的3’羧基端合成多核苷酸低聚物。如果把所需要的DNA片段与腺嘌呤核苷酸低聚物连接，而把载体分子接上胸腺嘧啶核苷酸低聚物，那么由于两者之间能形成互补氢键，同样可以通过DNA连接酶的作用而完成DNA片段和载体间的连接。④人工接头分子连接，在两个平整末端DNA片段的一端接上用人工合成的寡聚核苷酸接头片段，这里面包含有某一限制酶的识别位点，经这一限制酶处理便可以得到具有粘性末端的两个DNA片段，进一步便可以用DNA连接酶把这样两个DNA分子连接起来。 3、导入宿主细胞 将连接有所需要的DNA的载体导入宿主细胞的常用方法有四种：①转化，用质粒作载体所常用的方法。②转染，用噬菌体DNA作载体所用的方法，这里所用的噬菌体DNA并没有包上它的外壳。③转导，用噬