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脂肪干细胞向β细胞定向分化的研究 摘要：目的：探索治疗糖尿病的新途径，即脂肪干细胞是否能够定向分化为胰岛样细胞β细胞; 糖尿病 目录1 前言 1 2 实验材料与方法 1 2.1 实验材料 1 2.1.1 实验动物 1 2.1.2 主要试剂 1 2.1.3 主要仪器 1 2.2 实验方法 1 2.2.1 脂肪干细胞的分离、培养 1 2.2.2 脂肪干细胞的表面抗原鉴定 2 2.2.3 脂肪干细胞的诱导分化 2 2.2.4 葡萄糖诱导胰岛素释放 2 2.2.5 统计学处理 2 3 结果 2 3.1 脂肪干细胞的分离、培养 2 3.2 脂肪干细胞的表面抗原鉴定 3 3.3 脂肪干细胞的诱导分化 3 3.4 葡萄糖诱导胰岛素释放 3 4 讨论 3 参考文献 5 致 谢 7 1 前言 但是现在还是缺乏有效的彻底的治疗方法。糖尿病是因为胰岛β细胞或胰岛素抵抗的胰岛素，补充胰岛素是1型和2型糖尿病的传统治疗方法。胰岛素治疗虽能够控制病状、延迟和降低并发症的发生，却不能使糖尿病彻底根治。胰岛β细胞胰岛β细胞由于干细胞组织起源不同，增生和分化能力不同。涉及多关键技术技术糖尿病的治疗还有多问题解决。 2 实验 2.1 实验 8～10SD大鼠（体重250 g～300 g 2.1.2 主要试剂 75%乙醇、DMEM、I-型胶原酶胎牛血清牛血清白蛋白CD34、CD4、CD105HLA-DR（Serotec）；胰岛素、乙二胺四乙酸2.1.3 主要仪器 相差显微镜，荧光显微镜，恒温水浴箱，离心机，培养板，尼龙筛网 实验方法 .1 脂肪干细胞的分离、培养 处死SD大鼠，放在75%的乙醇中浸泡，大鼠前外下腹部两侧的三角形区域的脂肪组织组织的血管0.1%I-型胶原酶分钟，加10%胎牛血清的细胞培养基，1000 r/min离心10分钟；上清液未消化完全的脂肪组织5毫升细胞培养基重悬尼龙筛网过滤，1000 r/min离心10分钟上清液红细胞裂解液重悬沉淀1000 r/min离心5分钟过滤收集滤液，进行细胞计数，在25培养瓶中种植，在37%5%二氧化碳孵箱培养，后换培养基，后每换培养基天，细胞长满瓶底，0.3%Trypsin/0.03%EDTA消化加入5传代培养。 .2 脂肪干细胞的表面抗原鉴定 收集脂肪干细胞，1000 r/min离心5，的洗涤1次1000 r/min离心，加2毫升磷酸盐缓冲液，重悬洗涤细胞，1000 r/min离心5重悬，将细胞分装于1.5的PE管中，每管1，细胞密度为105 mL-1CD34、CD44、CD105、HLA-DR等分子进行标记[4]，然后加入PE管中。在冰上避光孵育，洗涤，流式细胞仪检测.3 脂肪干细胞的诱导分化 按照实验方法3.1中脂肪干细胞的培养方法培养大鼠脂肪干细胞，培养液中要除去bFGF-1和LIF，在鼠的脂肪干细胞融合达100%后，培养基10 mmol/ L尼克酰胺μg/L活化素A、10 nmol/ L GLP-1[6]。第一步：更换为含高糖的，其中添加1% 胎牛血清缓冲液，培养；第二步：更换为含低糖的，其中添加1%胎牛血清缓冲液，培养；第三步: 在7℃、5%二氧化碳、饱和湿度条件下培养。此后，每3天更换一次培养基。 2.2.4葡萄糖诱导胰岛素释放 干细胞胰岛分种24孔培养板在1MI-1640培养基配的低糖及高糖溶液中，37℃孵育不同时间，上清℃下存，上清胰岛素含量用放免法。 .5 统计学处理 应用SPSS 15.0统计软件，均数±标准差x±s），用t检验，P 0.05差异统计学意义。 结果 .1 脂肪干细胞的分离、培养 在倒置相差显微镜下观察，原代细胞接种后悬浮于培养瓶内，呈圆形铺满瓶底，此时可进行传代。传代8小时就可见细胞贴壁生长，呈圆形、多角形或长梭形于瓶底。可见细胞伸展，大多数细胞为长梭形，形态成纤维细胞。培养时，贴壁细胞形成集落，漩涡状生长，集落之间互相靠近，细胞已融合，培养瓶底面，再次传代。ADSC在传代后生长速度快，生长潜伏期较短，培养达到融合。体外培养20代以后，细胞的，细胞。.2 脂肪干细胞的表面抗原鉴定 选取了标记CD34、CD44、CD105HLA-DR分子，用流式细胞仪测定结果表明，从大鼠脂肪组织分离培养的干细胞CD44和CD105有表达，而CD34与HLA-DR表达，表明该细胞为脂肪来源。.3 脂肪干细胞的诱导分化 .4 葡萄糖诱导胰岛素释放 干细胞胰岛的胰岛素释放功能。，在高糖刺激干细胞胰岛释放胰岛素，细胞外上清中胰岛素浓度。表1 脂肪干细胞分化胰岛的胰岛素释放量（IU/L） Table1 The insulin release of the islet of adipose stem cells’ differentiation (IU/L) 释放胰岛素的细胞 n