电针对大鼠脑局部缺血再灌流后c-fos、mRNA表达影响.docVIP

电针对大鼠脑局部缺血再灌流后c-fos、mRNA表达影响(崇文区中医医院,北京100061;1首都医科大学附属北京同仁医院) 摘　要　采用Wistar大鼠,线栓法制作脑局部缺血再灌流动物模型,以原位杂交技术及苏木素-伊红(HE)染色方法,观察电针对缺血侧额叶、顶叶及海马各区内c-fos、mRNA表达并神经元组织形态学改变的影响。结果表明,电针能显著增强脑局部缺血再灌流后病灶侧额、顶叶皮层及海马各区c-fos、mRNA表达,并能减少缺血再灌流损伤后上述各脑区神经元的变性坏死。结果提示电针对脑局部缺血后受损神经元的保护作用可能与增强了c-fos、mRNA的表达有关。 主题词　电针　脑缺血/针灸疗法　c-fos类/代谢　RNA,信使/代谢　再灌注损伤　原癌基因蛋白质 c-fos基因是细胞内快反应基因,在神经系统缺血性损害时,呈一过性表达。目前,c-fos表达已被作为特定刺激下神经元功能活动的标志物。本实验研究采用更接近脑卒中临床实体的脑局部缺血再灌流动物模型,运用祖国医学的针刺方法,结合现代生物学的实验手段,旨在从分子生物学的角度为脑卒中后极早期的针刺治疗提供理论依据。 1　材料与方法 1.1　实验动物 选用健康雄性Wistar大鼠(由首都医科大学实验动物中心提供),体重200～250 g。动物麻醉采用3.5%水合氯醛,350 mg/kg腹腔注射。麻醉过程中以烤灯维持动物肛温在36.5～37.5 ℃。 1.2　动物模型制备及分组 1.2.1　模型制备　采用改良线栓法制作大鼠可逆性左侧大脑中动脉(MCA)缺血再灌流动物模型。步骤如下:大鼠麻醉成功后,仰卧固定于手术平台上。颈部正中开窗,分离暴露左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)及颈内动脉(ICA)。于ECA近分叉处做一小切口,插入尼龙线至ICA内约17 mm,结扎固定。再灌流时拔出栓子。 1.2.2　动物分组　实验用大鼠随机分为4组,即:缺血再灌流组(n=5,缺血1 h+再灌注1 h);缺血再灌流+电针组(n=5,缺血1 h+再灌流1 h+电针0.5 h);假手术组(n=3,单纯分离血管);假手术+电针组(n=3,假手术+电针0.5 h)。 1.3　针刺处理 1.3.1　取穴　依照大鼠经穴定位法,选取”百会”、”风府”2穴。 1.3.2　刺法　大鼠麻醉后,取腹卧位固定于手术平台上。”百会”穴以毫针向前斜刺2.5 mm,”风府”穴以毫针向后斜刺2.0 mm。针刺后以WQ-6F型电针仪给予电压为4.5 mV,间断频率15次/min,f?1为6 Hz,f?2为8 Hz两种频率交替的等幅疏密波电刺激。电针于左侧MCA闭塞后30 min开始,持续30 min。缺血再灌流组大鼠亦于同时相麻醉、固定,持续时间与缺血再灌流+电针组等长。 1.4　c-fos、mRNA检测 1.4.1　原位杂交　于实验末麻醉动物,经心腔依次灌注0.9%生理盐水及以0.01 mol/L磷酸缓冲液生理盐水(PBS)配制的4%甲醛溶液。断头取脑,置于4%PBS甲醛溶液中固定48 h。将鼠脑自额极向后至枕极冠状切为A、B、C、D、E 5个等份;依次行酒精梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋。取C、D脑片连续切片,片厚5 μm,贴附于预先涂有光学树脂胶(APFS)的载玻片上,用原位杂交技术进行染色。c-fos探针及链酶蛋白酶/辣根过氧化物酶(S-A/HRP)标记物抗体试剂盒均购于北京中山试剂公司。具体步骤严格按试剂盒说明书操作。阴性对照以羊血清代替c-fos探针。 1.4.2　观察方法　于C、D脑片连续切片中每隔6张取1张,共取10张;每张切片观察10个高倍视野(OLYMPUS BH-2型光学显微镜,×400倍),以测微尺计数c-fos、mRNA阳性细胞。 1.5　HE染色 石蜡切片常规脱蜡、脱水,HE染色,光镜下观察。 1.6　统计学处理 实验结果以均数±标准差(x±s)表示,以分组t检验进行显著性分析。数据处理采用SYSTAT软件包。 2　结果 2.1　神经元c-fos、mRNA表达 c-fos、mRNA表达阳性的神经细胞,胞核呈深棕色,胞浆不着色。假手术组与假手术+电针组在左侧各脑区内的c-fos、mRNA阳性细胞数均极少,两组间差异无显著性意义。与假手术组比较,缺血再灌流组与缺血再灌流+电针组左侧各观察脑区c-fos、mRNA阳性细胞数均极显著增加。两组均以额叶、顶叶皮层的Ⅱ～Ⅴ层神经细胞中表达更为强烈。与缺血再灌流组比较,电针组病灶侧各脑区c-fos、mRNA增加更为明显,尤以齿状回、额叶、顶叶皮层为著,海马CA1、CA4区神经细胞c-fos、mRNA阳性表达亦有显著增加(见表1)。