分子标记特点和应用.docVIP

分子标记技术方法和他们特点 1、限制性片段长度多态性标记分析(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)—RFLP RFLP技术的是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变(新产生和去除酶切位点) 和一段DNA 的重新组织(如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化) 等均可的产生 RFLP技术特点： RFLP技术优点： ①结果稳定，重复性好，特别是PCR-RFLP（CAPS）由于是特定引物扩增，退火温度高，因而假阳性低，可靠性更高。 ②是一种共显性标记，可区分纯合体与杂合体，数据多态信息量大，不受显隐性关系、环境条件、发展阶段及组织部位影响。 ③RFLP标记广泛存在于生物体内，不受组织、环境和发育阶段的影响，具有个体、种、属及各种各层次水平的特异性。 ④核基因组的RFLP标记表现为孟德尔的共显性遗传，而细胞质基因组的RFLP一般表现为母性遗传。 RFLP技术缺点： ①分析所需DNA量较大，分析速度慢。 ②步骤较多，周期长，技术复杂，费用高。 ③检测多态性水平过分依赖限制性内切酶，使多态性降低，对DNA质量要求高。 ④检测中需放射性物质，限制了广泛应用。 ⑤对于线粒体DNA而言，因为其进化速度快，影响种以上水平的RFLP分析的准确性。但是种以上水平影响很小。 2.随机扩增多态性DNA技术（Random Amplified Polymorphism DNA）— RAPD 以单一的随机引物(一般为10个碱基)利用PCR技术随机扩增未知序列的基因组DNA获得的DNA片段长度变异。它是利用随机引物通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。 RAPD技术特点： RAPD优点： ①无种属特异性,一套RAPD引物可以应用于任意一种生物的研究，具有广泛和通用的特点。 ②适合于自动化分析。操作技术简单，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术，省工省力和工作进度快。 ③不需制备探针、杂交等程序，引物价格低，成本较低。 ④.DNA用量少，允许快速、简单地分离基因组DNA。 ⑤不受环境、发育、数量性状遗传等影响，能够客观地提示供应材料之间DNA的差异。 RAPD缺点： ①是一种显性标记，用于二倍体生物时，区别纯合子和杂合子的困难性会引入统计分析。 ②.稳定性较差，在某些情况下，实验结果不能重复，结果可靠性低。 ③该技术的使用因生物种类而定。在细菌中，其因是单倍体，又是无性繁殖，所以RAPD标记技术很有用。 3任意引物.PCR标记技术（Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction）-AP—PCR AP—PCR分析中，所使用的引物较长(10－50 bp) ， PCR反应分为两个阶段，首先寡核昔酸引物在低严谨条件下与模板DNA退火，此时发生了一些合成，以便稳定模板与引物之间相互作用。然后进行高严谨退火条件的循环，两个位点间那些序列在低严谨度退火条件下发生的引物延伸可继续在高严谨条件下扩增。采用变性聚丙烯酞胺凝胶电泳分析PCR产物，最终反应结果与RAPD类似。只要设计的引物在低严谨退火条件下能减少引物产生人为产物，应用成对组合的引物可以产生新的AP—PC R谱带，但引物配对组合使用时，得到的图谱与单引物单独使用时产生的图谱之和很不相同，这样，50个引物能产生1250种不同指纹图谱。 　　 。 5、单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism)— SNP 核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism) 是基于DNA芯片技术的第三代DNA遗传标记技术。SNP是指同一位点的不同等位基因之间仅有个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失等。从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测，SNP 标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异。人类基因组大约每1250 bp SNP 出现一次，已有2000多个标记定位于人类染色体，对人类基因组学研究具有重要意义 SNP特点： ①密度高：SNP在人类基因组的平均密度估计为1?1000 bp , 在整个基因组的分布达3 ×106 个, 遗传距离为2--3cM , 密度比微卫星标记更高, 可以在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标记。 ②富有代表性：某些位于基因内部的SNP 有可能直接影响蛋白质结构或表达水平, 因此, 它们可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素。 ③遗传稳定性：与微卫星等重复序列多态性标记相比, SNP 具有更高的遗传稳定性。 ④易实现分析的自动化：SNP 标记在人群中只有两种等位型(allele), 故也称为双等位标记(biallelic marker)