生物工程制药笔记重点及难点.docVIP

第一章 绪论 1、生物技术制药是指采用现代生物技术可以人为地创造一些条件，借助某些微生物，植物或动物来生产所需的医药品。 它包括基因工程制药，动物细胞工程制药，抗体制药，植物细胞工程制药，酶工程制药。 4、生物技术药物的分类，按功能用途分： 一是治疗药物，独特的生理调节，毒副作用低；二是预防药物，传染性疾病；三是诊断药物，疾病的临床诊断，速度快，灵敏度高，特异性强 5、生物技术制药的特性：高技术、高投入、长周期、高风险、高收益 第二章 基因工程制药Gene Engineering for Biopharmaceutics 第二节 基因工程药物生产的过程 基因工程制药所使用的生物技术（1）DNA重组技术（2）淋巴细胞杂交瘤技术（3）细胞培养技术（4）克隆表达技术 DNA重组技术 DNA重组（DNA recombination）指DNA分子内或分子间发生的遗传信息的重新共价组合过程。包括同源重组、特异位点重组和转座重组等类型，广泛存在于各类生物。体外通过人工DNA重组可获得重组体DNA，是基因工程中的关键步骤。 淋巴细胞杂交瘤技术 又称单克隆抗体技术。它是在体细胞融合技术基础上发展起来的。克勒（Kohler）和米尔斯坦（Milstein）（1975）证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。 基因工程制药生产的基本步骤 流程图 获得目的基因--组建重组质粒--构建基因工程菌或细胞--培养工程菌--产物分离纯化--除菌过滤--半成品检定--成品检定--包装 上游阶段 主要是分离目的基因和构建工程菌细胞，其工作主要是在实验室内完成。具体内容包括： （1）获得目的基因 （2）用限制性内切酶和连接酶将目的基因插入到适当的载体质粒和噬菌体之中 （3）将重组后的基因转移到大肠杆菌或者其它宿主细胞内 3、下游阶段 是指从工程菌的大规模培养，一直到产品的分离纯化，其工作主要是将实验室成果产业化、商品化。其工作重点是： （1）必须保证所表达的蛋白质具有生物活性， （2）考虑基因工程蛋白质表达量的多少， （3）蛋白质分离纯化的难易程度。 第二节 目的基因的获得 一、反转录法 反转录法就是分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA 克隆表达。 1、 mRNA的纯化2、cDNA第一链的合成3、cDNA第二链的合成4、cDNA 克隆5、将重组体导入宿主细胞6、cDNA 文库的鉴定7、目的cDNA克隆的分离和鉴定 1、mRNA的纯化（mRNA purification） ①细胞内RNA的组成和含量： DNA：95%核内，5％细胞器 RNA：75％细胞质，10%核内，15%细胞器 rRNA： 80-85% RNA tRNA： 10-15% mRNA：2-5% ②真核细胞mRNA 的特点及分离纯化方法。 3’-polyA（20-250AAA）-oligo(dT) cDNA第一链的合成 由于mRNA的3-末端常常含有一多聚腺苷酸polyA，所以可以用寡聚脱氧胸腺苷酸Oligo（dt）做引物，在逆转录酶的催化下，合成cDNA。 为了测算cDNA的合成效率，可以在合成反应体系中加入一种放射性标记的dNTP，如a-32P-dATP、a-32P-dCTP，这样就可以通过放射自显影技术，来计算出dNTP的渗入量。 cDNA第二链的合成 先用碱水解的方法，或者用RNaseH酶解的方法，除去cDNA-mRNA杂交链中的mRNA链。然后，再以cDNA第一链为模板，在DNA聚合酶的作用下，合成DNA互补双链。 cDNA的克隆 当cDNA的插入片段小于10KB时，应选用质粒载体。 当cDNA的插入片段大于10KB时，应选用噬菌体载体。 表达型----是指重组后插入的cDNA能够经过转录、转译，最终合成蛋白质。 非表达型----是指重组后插入的cDNA不能经过转录、转译，合成蛋白质。 质粒 噬菌体 表达型 PUC λgt11 非表达型 pBR322 λgt10 cDNA的片段与载体的连接 （1）借助同型多聚体尾巴的连接方法----用3-末端脱氧核苷酸转移酶催化，在cDNA的末端加上polyG（或者polyT）的尾巴、而在载体的末端加上polyC（或者 polyA）的尾巴，就能够实现cDNA的片段与载体DNA的连接。 （2）加人工接头的连接法----所谓加人工接头的连接法，是指用采用T4DNA连接酶，在cDNA的末端加上人工接头，然后再使用特定的限制酶