细胞生长和增殖过程的培养.ppt

培养细胞的生长增殖过程 第四节 一体外培养细胞的生长增殖过程 原代培养期:从体内取出组织接种培养到第一次传代培养这个阶段，一般持续1-4周。这个阶段细胞比较活跃，有细胞分裂，但不旺盛。 传代期：从原代培养的细胞的一经传代后便称细胞系。细胞增殖旺盛，当传代10-50次后，细胞增殖缓慢，以致完全停止。 衰退期：细胞增殖缓慢或不增殖。细胞轮廓增强，最后衰退凋亡。 初代培养 细胞系 （连续细胞系） 二培养法 培养瓶培养法 培养板培养法 A 培养瓶培养法 所谓培养瓶培养法，就是将培养对象直接接种于培养瓶内，再放人培养箱进行培养。 早期的培养瓶是玻璃培养瓶，目前主要用一次性的塑料培养瓶。与一般瓶子不同，采用的材料都是透明、对生物细胞无毒的材料。采用的玻璃大多是硼硅酸玻璃。形状主要采用适合细胞贴壁生长和显微镜观察的扁平形状。  与此相关的一种方法是盖玻片+培养瓶培养，就是以盖玻片为生长表面，将拟培养的组织、细胞接种于盖玻片上，然后放进培养瓶中进行培养。这样具有以下几优点：。 (1)可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养物的影响。 (2)可以方便地进行显微镜观察、染色等操作，以及永久保存。 （3）增加了培养瓶的培养面积。 B 培养板培养法 培养板培养法曾被称为微量培养法，是现代体外培养技术最为常用的方法之一。具体做法是将培养细胞接种在培养板的孔内，然后在C02培养箱内培养。最常用的培养板有6孔、24孔和96孔培养板，后者最为常用。一般都是一次性使用。 三 原代培养技术  幼体比老龄更容易培养，尤其是胚胎组织；分化低比分化高的容易培养；肿瘤比正常组织容易培养。任何动物细胞培养均从原代培养开始。原代培养分为两种：组织块培养法和组织消化培养 原代培养 包括：取材、分散细胞、接种、培养等． 在所有操作中，多都要注意保持培养物及生长环境的无菌条件。 组织块培养 组织块的原代培养方法，首先从机体某部位取下组织，方法： 处死动物 将组织块剪碎 Hanks液 冲下剪刀上的碎块，补加3~5mLHanks液 吹打、低速离心、弃上清液、留下组织块 吸管取出组织块放入培养瓶内，使其贴在瓶壁上，（有组织块的瓶壁朝上）加入培养液 培养 传代 组织块也可用两只手术刀片将组织块切碎，这样对细胞损伤较小，但操作时间长，容易污染。 对某些软组织如肿瘤、胚眙、脑等可将碎组织块放人注射器玻璃管中挤压分离。 组织消化培养 1、取材分离和组织消化：用生物化学方法将剪碎的组织分散成细胞团或单细胞。胰蛋白酶，适用于细胞间质较少的软组织。 2、培养过程： 处死动物 ---- 将组织块剪碎 Hanks液 冲下剪刀上的碎块，补加3~5mLHanks液 吹打、低速离心、弃上清液、留下组织块 :组织消化-----吸管取出组织液放入培养瓶内，加入培养液 ------ 培养--- 传代 接种 加入培养基 培养（每次换液后更换新的瓶塞 ） 根据细胞生长的特点，传代方法有3种： 1．悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2．半悬浮生长细胞传代 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。 3．贴壁生长细胞传代 贴壁细胞细胞在培养瓶长成致密单层后，继续生长的空间不足，培养基中的营养成份也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，需要分瓶培养，对细胞进行传代扩增。 1.首先将超净工作台用紫外　光灯照射灭菌20-30分钟； 2. 关闭超净工作台内的紫外光灯,点燃酒精灯(一切操作均需在酒精灯火焰下进行) 3.将消毒过的所用物品放入超　净工作台中； 4.将培养好的HeLa细胞培养　皿放入超净工作台中； 5.用无菌吸管将细胞上原有的　培养液吸净，弃去培养液。  7.将加有胰酶消化液的培养皿放入37℃温箱中消化1分钟 8.从温箱中取出培养皿后用手轻轻拍打培养皿的边缘； 9.用倒置式显微镜观察细胞　是否完全脱落 细胞完全皱缩变圆，此时应弃去胰酶，加入培养基后轻摇可将细胞从细胞瓶壁上洗下，将细胞