影响嵌合孤雌胚胎发育因素和嵌合囊胚离散细胞不同性别来源比率的研究.pdfVIP

摘要 影响嵌合孤雌胚胎发育因素 和嵌合囊胚离散细胞不同性别来源比率研究 临床兽医学专业硕士研究生 李永强 指导教师 李跃民教授 摘 要 随着干细胞技术的不断发展，能够用于人类再生医学的具有克服免疫排斥反应的治疗性 胚胎干细胞逐渐成为人们研究的热点。通过体细胞核移植技术获得的胚胎干细胞，因为具有 与体细胞提供者相同的基因型被认为是克服免疫排斥反应的最佳途径，然而，取于患病动物 的体细胞是一种隐含有突变基因的分化细胞，不但克隆囊胚生成率很低，而且因含有突变基 因，通过体细胞克隆途径所获得的胚胎干细胞的质量也会存在问题。与此相比，孤雌胚胎干 细胞则因为是来源于具端粒酶活性且尚未经历个体分化途经的生殖细胞，理伦上这种来源于 生殖细胞的干细胞不存在当代受治疗动物的突变基因，因此，这种孤雌胚胎干细胞(pES)系 的医学应用前景更广阔，意义重大。同样，来源于哺乳动物MII期卵母细胞孤雌激活胚胎与 克隆胚胎相比，具有与提供卵母细胞母体相同的组织相容性复合物，由此获得的干细胞也能 够像体细胞克隆胚胎干细胞一样克服免疫排斥反应。但是，来源于MII期卵母细胞孤雌激活 胚胎则因为缺乏父源基因印迹作用，其发育潜能受到限制，从而导致其分离获得干细胞的分 化潜能也有可能因此而受到限制：由于雄性基因组在胚胎发育中是必须的，那么，利用MII 期卵母细胞获得的孤雌胚胎与经性别鉴定的雄性胚胎进行嵌合发育，可以在一定程度辅助孤 雌胚胎发育，并且可以用性别鉴定的方法鉴定得到的囊胚内细胞团是否来源于孤雌胚胎。 本实验选择昆白小鼠为研究对象，针对孤雌胚胎干细胞获取新途径中，有性生殖胚胎与 无性生殖孤雌胚胎嵌合发育有可能在早期胚胎细胞间通过旁分泌与自分泌因素促进孤雌胚发 育的道理，本研究通过性别鉴定的方法选择雄性有性生殖胚胎与无性生殖MII期卵母细胞孤 雌激活胚胎嵌合发育，并通过性别鉴定的方法将这种由嵌合发育囊胚分离得到的细胞集落进 行来源标记，旨在通过应用成熟的分子生物学性别鉴定方法，建立一种新的有性生殖雄性胚 胎辅助提高与其嵌合的无性生殖孤雌胚胎发育生成囊胚的比率，并进一步通过这种性别鉴定 方法，为分离鉴定由此囊胚获取孤雌胚胎干细胞的性别标识新模式奠定基础。试验结果如下： 1小鼠孤雌胚胎与雄性胚胎嵌合发育影响因素研究 本研究取小鼠MII期卵母细胞进行孤雌激活，体外培养至8．细胞期，与经性别鉴定后获 得的8．细胞期雄性胚胎嵌合培养，其目的是为了建立一种新的异性胚胎嵌合培养模式，在便 于通过分子生物学方法对胚胎不同来源进行性别鉴定的基础上，研究两种不同类型胚胎细胞 之间在嵌合发育过程中的相互影响，为从嵌合发育胚胎中分析标记来源于孤雌胚胎的干细胞 研究过程奠定基础。本研究在初步建立孤雌激活胚胎与雄性胚胎嵌合发育程序的基础上，对 于影响这种嵌合胚胎发育效果的几个主要因素做了进一步的研究。 两南大学硕十学位论文 1．1获取小鼠二倍体孤雌胚胎的孤雌激活方法研究 已知哺乳动物孤雌胚胎有几种染色体核型，孤雌胚胎不同倍性染色体核型的形成与卵母 细胞孤雌激活的方式有关，其中杂合二倍体是一种在染色体质量上类似于有性生殖胚胎体细 胞核型的无性生殖孤雌胚胎，为了获取这种胚胎，本研究通过两种化学方法激活昆白小鼠成 熟卵母细胞，并抑制其第二极体排出，在显微操作仪下观察激活卵是否形成两原核，若形成 则确定为杂合二倍体，本实验旨在选择生成杂合二倍体孤雌胚胎效率最佳的孤雌激活方法用 于制作与雄性胚胎嵌合发育的8细胞期孤雌胚胎。结果显示：采用含10mmoFL的Srcl2和 5ug／mlCB处理4小时，激活率最高为76．7％，激活小鼠卵母细胞后形成杂合二倍体孤雌胚比 例最高为39．5％，与乙醇联合6-DMAP激活后形成杂合二倍体孤雌胚比例31．6％略高，但差异 不显著(pO．05)。 1．2小鼠孤雌胚胎早期发育的培养体系研究 小鼠卵母细胞孤雌激活之后，选取杂合二倍体胚胎，通过在不同培养液中的培养，对培养 得到的2、4细胞和囊胚进行统计，旨在建立一套完善的适合杂合二倍体孤雌胚胎体外培养的 体系，试验结果如下： CZB添加FBS组的囊胚发育率高于其他各组，差异显著(pO．05)。 育率稍好于未添加组，两组的囊胚发育率都明显高于全程添加组，且差异显著(pO．05)，。 发