蛋白鉴定分析2.pptVIP

* 3蛋白质的等电点测定技术 3.1等电聚焦电泳(Isoelectrofocusing，简写IEF) 3.1.1原理 通常是指聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳。它是60年代初建立起来的一种蛋白质分离手段，现在已经成为单向蛋白质电泳分辨率最高的一种分离技术，其分辨率可以达到0.01个pH值，有的文献报道可以达到0.001个pH值。它是利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点的差异进行电泳分离和分析。蛋白质在一个稳定的线性pH梯度的凝胶中电泳，蛋白质朝着与自身电荷相反的方向移动，在移动的过程中不断被凝胶中的反离子中和，最后静电荷完全被中和而停止运动，聚焦在等电点的位置。 3.1.2蛋白质与两性电解质 (1)载体两性电解质： 在等电聚焦电泳中，载体两性电解质具有以下两种功能： A 中和功能： 两性电解质的性质在分离系统中形成一个平衡稳定的pH梯度，提供中和蛋白质电荷的离子，具有pH缓冲能。 B 载电功能： 两性电解质作为电的载体，具有运载“电流”的能力，有良好的导电性能 (2)蛋白质的等电点 蛋白质属于一种两性电解质。在不同的pH环境中所带的正负电荷不同。若在某特定的pH环境中其净电荷为零，此时的pH为该蛋白质的等电点，在电场下不泳动。 ? 3.1.3载体两性电解质分类及pH范围 根据建立pH梯度的原理的不同，可以分为载体两性电解质pH梯度(Carrier Ampholytes pH Gradient)和固相pH梯度(Immobilized pH Gradient)。前者是在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度，后者将缓冲基团作为凝胶介质的一部分，分辨率比前者高一个数量级。 名 称 产 家 组 成 分子范围 pH范围 Ampholine Pharmacia (LKB) 脂肪族多氨基,多羧基的异构体和同系物组成 1000-6000Da 2.5-4.5 4-6.5 5-8.0 3.5-9.5 Pharmalyte Pharmacia 七氨基多羧基 1000-15000Da 2.5-5 4-5.5 5-8.0 8-10 3-10 Servalyte Serva 丙烯基乙胺与乙烯基亚胺缩合 800-1200Da 2-4.0 4-6.0 6-8.0 2-11 载体两性电解质 国产 脂肪族的多氨基,多羧基的异构体和同系物组成 800-1200 Da 3-9.5 3.5-5.5 4.0-6.0 6.0-9.0 7.0-10 3.1.4电极液 根据不同的pH范围,选用不同的电极液,见下表 pH范围 阳极电极液 阴极电极液 3.5-9.5 1mol/L 磷酸 1 mol/L NaOH 2.5-4.5 1 mol/L磷酸 0.4M HEPES 4.0-6.5 0.5 mol/L 醋酸 0.5 mol/L NaOH 5.0-8.0 0.5 mol/L 醋酸 0.5mol/L NaOH 2.5-4.0 1 mol/L 磷酸 2%两性电解质 pH6-8 3.5-5.2 1 mol/L 磷酸 2%两性电解质 pH5-7 4.5-7.0 1 mol/L 磷酸 1 mol/L NaOH 5.5-7.7 2%两性电解质 pH4-6 1 mol/L NaOH 6.0-8.5 2%两性电解质 pH4-6 1 mol/L NaOH 7.8-10 2%两性电解质 pH4-6 1 mol/L NaOH 3.1.5方法 制胶 ? 加样 ? 电泳 ? 固定 ? 染色 ? 脱色 ? 计算 ? 3.1.6 pH值测定 (1)标准曲线法： 标准样品参照，绘制标准曲线 (2)微电极法： 微电极直接测定 3.2聚焦层析(chromatofocusing) 3.2.1原理 (1)pH梯度的形成 一般的离子交换色谱中，pH梯度的产生，通常利用pH梯度混合器来制造连续的pH梯度。而聚焦色谱则是利用离子交换剂本身的带电基团的缓冲作用形成梯度。当洗脱缓冲液通过聚焦离子交换介质时，就会自动形成pH梯度。在高pH缓冲液的平衡，使色谱柱内的介质均处于碱性条件，带有电负性的碱性基团，根据载体两性电解质的等电点不同，所带的电荷有差异而形成pH梯度。 (2)聚焦效应 当一种蛋白质在色谱柱内随洗脱液前移至接近其pI处时,此时的移动速度明显减慢。如果同样的组分第二次加样，起初它带负电荷,向正电荷(低pH)方向移动速度快，直至追上慢速移动的第一次加样的组分，而聚焦到一起，然后两次加样的同一组分一起前移，直至停留在pI处。 3.2. 2 聚焦介质 聚焦介质是以交联的琼脂糖凝胶为载体合成的,具有凝胶介质的基本