(2014年版本)实验方案范例.docxVIP

实验方案范例备注：红色字体部分请根据实验实际条件修改。一、基因操作1、基因A（GeneA）的敲减载体构建版本1：针对GeneA，在Sigma网站上搜索已验证过敲减效率的shRNA序列，合成后两端加上酶切位点，合成双链DNA oligo，成为含干扰序列的具对应粘性末端的shRNA表达框架。以EcorI和BamHI内切酶酶切pGP载体以使其线性化，形成不对称的粘性末端。将shRNA表达框架插入pGP，转化大肠杆菌感受态细胞，阳性克隆行PCR鉴定与测序，构建含有针对GeneA的shRNA骨架质粒。版本2：从Genebank调取人GeneA核苷酸序列，利用Ambion数据库软件设计针对GeneA的有效的shRNA序列，经Blast 比对进行同源性分析后，选出特异性较高的3 组分别命名，以可以被任意替换的茎干发夹结构作为阴性对照。取pGP shRNA载体15μL 于EP 管， 用BamHI 1.5μL 与EcoRII 1.5μL、10×buffer 5μL 酶切反应4 h 以上；产物回收加入T4 DNA Ligase 使GeneA shRNA 片段与目的载体连接，连接产物加入至DH5α感受态细胞中转化；用高纯质粒小量提取试剂盒进行质粒提取，同时挑取阳性克隆行PCR 鉴定、DNA 测序。2、GeneA过表达载体构建从Pubmed Nucleotide数据库中检索针对目的基因的CDS序列，将序列导入DNAMAN软件中，进行酶切位点分析；在该序列中不包含的酶切位点中，选择克隆载体上多克隆位点中有的两个限制性内切酶——EcoRI和SacII。引物直接在GeneA CDS编码区起始和末端设计，然后在引物的5’端加上相应的酶切位点。以cDNA为模板扩增目的基因片段，电泳胶回收目的片段后用其两端酶切位点处理片段并纯化回收。以同样的酶切位点处理pCDH载体以使其线性化，胶回收载体后与片段连接并转化DH5α感受态细胞，通过PCR鉴定阳性克隆并测序。3、GeneA点突变载体构建版本1：根据突变位点特异性设计突变寡核苷酸引物并合成含突变位点且互补的两条引物。在PrimeSTAR? GXL DNA Polymerase 聚合酶的作用下，合成整个含有突变位点的质粒。在反应液中加入Dpn I 显著性内切酶，37℃ 1 h。Dpn I 只能切断腺嘌呤甲基化的DNA， 能将含有甲基化的原始模板消化，留下没有甲基修饰的突变质粒。将反应液转化入感受态大肠杆菌。PCR 所得的突变质粒的缺口能在大肠杆菌中得到修复，所获得的菌落即含有突变质粒。版本2：使用Hieff Mut? Site-Directed Mutagenesis Kit定点突变试剂盒构建GeneA点突变载体。针对需引入突变的区域设计含突变位点的引物，将质粒进行反向PCR扩增，扩增产物与DpnI混合，置于37℃恒温反应1～2小时进行消化，去除甲基化模板质粒。配制含有Exnase的单点突变重组反应体系。置于37℃反应 30 min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5 min。取20 μl冷却反应液，加入到200 μl感受态细胞中进行转化，随后取100 μl菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上，长出来的阳性克隆PCR，测序鉴定。4、GeneA敲除载体构建（CRISPR/Cas9法）从NCBI数据库中查询GeneA的CDS序列，在外显子中确定待敲除的序列，选择23-250bp的外显子序列输入软件中，进行特异sgRNA设计，根据输出的sgRNA模板序列，合成一对序列互补的DNA Oligos。将合成的Oligos以逐步降温的方法退货成双链，然后与Cas9质粒进行连接，转化DH5α感受态大肠杆菌细胞，涂板，阳性克隆测序，正确的阳性克隆，小抽后获得含shRNA表达元件的Cas9质粒。错配酶法检测剪切活性：靶序列PCR扩增后经变性、退火，将形成错配。错配酶（CEL1或T7E1酶）将识别错配的杂合双链并剪切。产物跑电泳，比较切割条带与未切割条带的比例，判断Cas/sgRNA的活性。二、病毒包装1、慢病毒包装使用Clontech公司的Lenti-XTM HTX packaging System第四代慢病毒包装系统。转染前约24 hr，以4-5×106 Lenti-X 293T细胞/100 mm板的密度接种10 ml细胞，培养过夜。按照说明书，将致力DNA转染体系和polymer体系分别混匀，再将两者混合后室温孵育10min后滴加至293T细胞中，十字形摇晃混匀。4小时候换液，继续培养48小时，收获病毒上清，500g离心10min去除细胞碎片，冻存于-80℃待用。Lenti-X GoStix?检测病毒滴度或者按照梯度稀释法，转染293T细胞，根据感染效率判断滴度。2、腺病毒/腺相关病毒包装取5μg重组质粒用PacI酶切然后胶