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3730XL测序基本流程 汪大海 深圳华大基因研究院 散样组 准备模板：质粒、PCR产物 电泳鉴定DNA浓度和质量 测序PCR反应 纯化测序产物（上机前纯化） 上机 分析数据 一 质粒DNA的提取 碱裂法提取质粒操作步骤 溶液I的组分：1.0M Tris-HCl / 0.5M EDTA，pH8.0，用前按比例加入RNase酶 溶液I的作用：菌体悬浮 EDTA是在溶液I中主要起抑制DNase的作用 。 如果缺了溶液I，我们也可以用等体积的水或LB培养基来悬浮菌体。 特别注意：菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。 RNase酶未加或失活 溶液II的组分： 0.4 N NaOH / 2% SDS； 两种溶液等体积混合后使用 ，必须现用现配 溶液II的作用：裂解作用 溶液II在天气冷时会产生絮状沉淀，可温水预热至沉淀消除。 SDS是离子型表面活性剂。它主要作用是： a.溶解细胞膜上的脂质与蛋 白，从而破坏细胞膜。 b.解聚细胞中的核蛋白。 c.能使蛋白质变性而沉淀下来。 这一步要注意两点： 第一，时间不能过长，尽量不要超过5min。因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂； 第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。 溶液III的组分：3 M 乙酸钾 ， 冰乙酸调PH值至4.8～5.2。 溶液III的作用: 中和作用 3mol/L pH4.8~5.2的乙酸钾溶液是为了把抽提液的pH调至中性，从而使变性的质粒DNA复性，且稳定存在。 溶液III加入后的沉淀实际上是K+置换了SDS中的Na+形成了不溶性的PDS(十二烷基硫酸钾potassium dodecylsulfate) 二 电泳鉴定 好图 对DNA的纯度要求 尽量去净： 残留的盐分和SDS 蛋白质 残留的RNA  RNA 1ug PEG 0.3% NaAc 0.5 mM Ethanol 1.25% Phenol/CHCl3 0% CsCl 5 mM 三 测序的PCR反应 测序反应 DNA 1 ?L BigDye 4 ?L 引物 (3.2 pmol / ?l) 1 ?L 去离子灭菌水 4 ?L 总体积 10 ?L 测序PCR循环条件 96 ?C 1 min ? (96 ?C 10 sec ? 50 ?C 5 sec ? 60 ?C 4 min) x 25个循环 ? 4 ?C保温 ABI BigDye 3.1的组成成分 测序酶 脱氧的dNTP 双脱氧的dNTP(荧光标记) Mg2+ ddH2O buffter DNA测序模板用量 PCR产物 100-200 bp 1- 3 ng 200-500 bp 3-10 ng 500-1000 bp 5-20 ng 1000-2000 bp 10-40 ng 2000 bp 20-50 ng 质粒 150-300 ng 大分子量模板(Cosmid、BAC) 0.5-1 ?g 细菌基因组DNA 2-3 ?g 引物与模板的平衡最关键 质 粒 200 ng : 3.2 pmol PCR产物 100-200 bp 1-3 ng : 3.2 pmol 200-500 bp 3-10 ng : 3.2 pmol 500-1000 bp 5-20 ng : 3.2 pmol 为什么要定量 浓度太低：会导致反应不充分，测序信号较弱。 浓度太高： 1.会导致小片段进样过多，信号迅速衰减（见下图）。 2.DNA中包含较多杂质，会对后续测序反应产生影响。 PCR与测序反应的比较 四 测序产物纯化（上机前纯化） 目的： 去除未结合的荧光染料终止物 去除残余的引物、盐离子、酶等 电进样对DNA纯度的要求 毛细管和电极置于样品溶液中，加电压后，荷负电的DNA进入毛细管，向正极泳动。信号强度(进样量)取决于DNA片段的荷电量、片段大小及与杂质的竞争。 分子越小，上样越快 盐离子、RNA、蛋白质等与DNA片段竞争 举例 酒精/EDTA/NaAc法 每管加入1 ?L 125