肿瘤的早期诊——端粒酶活性的检测.pdf

中国医科大学 硕士学位论文 肿瘤的早期诊断——端粒酶活性的检测 姓名：郝凤进 申请学位级别：硕士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：于秉治 2001.4.1 中 文 摘 要 前 官 十年代末，Muller在x一射线照射果蝇染色体实验中首次 提出了端粒(Telomere)的概念，该命名取自希腊语，直译为”末端 的部分11特指真核细胞染色体的物理末端，近年来通过对某些生 物端粒的分子水平研究发现:端粒是真核生物线状染色体一种特 异质化结构，由一简单重复的G的DNA序列及蛋白组成，不同物 种的端粒DNA序列并不一致，人和各种脊椎动物端粒DNA序列 均为(5一‘TTAGGG一3)n端粒对于维持染色体末端提供了一个保 护性的”帽子”，防止染色体互相融合，重组以及一些外切酶，连接 酶作用，端粒还参与染色体在核内的定位及基因的表达调控，对染 色体末端限制性片段(terminalrestrictionrfagmentsTRFs)的分析， 能得到一个细胞群体端粒的平均长度，在人增殖细胞中均为12- 15kb。在体外培养的纤维母细胞等细胞系中测不同时期的端粒长 度时，观察到由于端粒随细胞分裂而不断短缩至一定程度时，细胞 将停止分裂，进人老化期，甚至死亡，此期称为M,期，也称为监控 点激活(checkpointactivation)。其发生机制尚不清楚，目前倾向 下列两种可能:1.端粒DNA缺失至一定程度激活户3或Rb等肿 瘤抑制基因，作用于细胞周期启动凋亡;2.启动凋亡的一些基因 位于端粒附近，完整的端粒结构可抑制其附近基因表达，当端粒太 短不足以抑制这些基因时，细胞将发生凋亡，端粒因此有许多重要 的生理学功能，其中最被关注的是其在细胞衰老和肿瘤中的作用. 端粒酶是一种核糖蛋白复合体，可以自身RNA为模板合成端粒重 复序列.在恶性肿瘤组织及其脱落细胞中，端粒酶活性检出率很 高，而正常人体细胞，除生殖细胞和少数造血细胞低水平表达外， 端粒酶一般处于失活状态，现已证明端粒酶包括三个主要成分，即 人端粒酶RNA(hTR)，端粒醉催化蛋白亚单位(hTRT)和端粒醉相 关蛋白(TP1/TLPI).最近有学者发现:端粒酶三各组分中hTRT 的逆转录活性是端粒酶活性的决定因素，故检 TmRNA可反 应端粒酶的活性，进而对恶性肿瘤做出判断 文根据文献报道的 hTRTcDNA序列设计引物，建立了hTRTcDNA的RT一KR检测 法，并初步研究了肿瘤脱落细胞的hTRTmRNA的表达情况。 材 料 与 方 法 1本实验建立了RT一PCR方法，探讨了反应的扩增动力学，检 测了大量的尿液，胸水的端粒酶活性。 1.材料 肿瘤患者的尿液和胸水均来自于中国医大附属一院患者。 2.方法: 2.1总RNA提取:取尿液或胸水50m1，用TRIzol，异丙醇，抓 仿等提取总RNA，提出的总RNA用20川DEPC处理过的水稀释 后，取2讨留做进行紫外检测，其余的分装后放在一20℃保存。 2.2 用紫外分光光度计进行紫外测定总RNA含量及纯度。 2.3CDNA第一链的合成，用反转录试剂盒将总RNA转录 成cDNA第一链，反应体积为10贝。 2.4 扩增hTRTcDNA片段，用反转录产物为模板，用PCR方 法扩增hTRTcDNA片段，其引物为:上游引物序列为5’一cTG- CACTGGCTGAGTGT一3下游引物序列为5’一CTGAACAGTGCCT- TCACCCT一3;反应总体积为25wlo 2.5 电泳检侧PCR扩增产物，扩增后的产物加样到12%的 聚丙烯酞胺凝胶中，电压80V,90分钟，之后用EB(澳化乙锭)染 色。 实 验 结 果 1.提取的总RNA在紫外分光光度计下检侧RNA的纯度