.蛋白质性质实验.docx

实验六蛋白质的性质（二）蛋白质的等电点测定和沉淀反应一、蛋白质等电点的测定（一）目的1、了解蛋白质的两性解离性质。2、学习测定蛋白质等电点的一种方法。（二）原理蛋白质是两性电解质，在溶液中存在下列平衡：蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶掖的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的PH值称为此蛋白质的等电点(p1)。不同的蛋白质有其各自的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质来测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是利用物质在达到等电点时溶解度最小的性质，测定蛋白质溶液的溶解度呈现最低时的溶液pH值，此时的pH倍即为该蛋白质的等电点。本实验通过观察酪蛋白在不同pH溶液中的溶解度，来测定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠配制成各种不同PH值的缓冲液．然后向各缓冲溶液中加入酪蛋白，观察沉淀出现并测定酪蛋白的等电点。（三）实验器材1、水浴锅。2、温度计。3、200mL锥形瓶。4、100mL容量瓶。5、移液管。6、试管。7、试管架。8、研钵。（四）材料与试剂 1、0.5％酪蛋白醋酸钠溶液：取0.5g酪蛋白．加少量水在研钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质液移入200 mL锥形瓶内，并用少量40～50℃的温水洗涤研钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。加入10 mLlmol/L醋酸钠溶液。把锥形瓶放入50℃水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶内的溶液全部移至100 mL容量瓶内，加水至到度，塞紧玻璃塞，混匀。2、1mo1/L醋酸溶液。3、0.1mo1/L醋酸溶液。4、0.01mo1/L醋酸镕液.（五）操作方法1、取同样规格的干燥试管9支,按表3-8顺序分别准确地加入各试剂，然后混匀。试管编号123456789加入试剂蒸馏水2.403.202.003.003.501.502.753.381mo1/L醋酸（ml）1.600.800.1mo1/L醋酸（ml）4.002.001.000.500.01mo1/L醋酸（ml）2.501.250.62酪蛋白醋酸钠（ml）1.001.001.001.001.001.001.001.001.00溶液最终pH3.53.84.14.44.75.05.35.65.9沉淀出现情况2、。静置20min后，再观察每支试管内溶液的混浊度，以—、＋、＋＋，＋＋＋符号表示沉淀的多少，根据观察结果，指出那一个pH是酪蛋白的等电点。二、蛋白质的沉淀及变性（一）目的1、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。2、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。3、了解蛋白质变性与沉淀的关系。（二）原理在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应可分为两类。 1、可逆的沉淀反应：此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，沉淀的蛋白质仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇(或丙醇)短时间作用蛋白质等。一般在纯化蛋白质时，常利用此类反应。 2、不可逆沉淀反应：此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质因变性而沉淀，除去引起沉淀的因素后，蛋白质不再溶于原来溶剂中。如加热引起的蛋白质沉淀与凝固、蛋白质与重金属离子或某些有机园的反应等都属于此类。但蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在(如电荷)，并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。（三）材料与试剂1、蛋白质样液；与双缩脲反应相同。2、饱和硫酸铵溶液3、固体硫酸铵。 4、5％Cu2SO4溶液。 5、3％AgNO3溶液。 6、0.1％Na0H溶液。 7、10％醋酸溶液。 8、95％酒精； 9、固体氯化钠。10、1％醋酸溶液。11、10％醋酸溶液。12、10％氢氧化钠溶液。13、饱和氯化钠溶液。14、饱和鞣酸溶液。 15、5％三氯醋酸溶液。（四）操作方法1、蛋白质的盐析作用 (1)实验原理一般蛋白质在高浓度盐溶液中溶解度下降，故向其溶液中加入中性盐至一定浓度时，蛋白质即自溶液中沉淀析出，此现象称为盐析。盐析作用与两种因素有关；①蛋白质分子被浓盐脱水；②分子所带电荷被中和。用盐析方法沉淀蛋白质时，较少引起蛋白质变性，经透析或用水稀释时又可溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质种类及pH有关。分子量大的蛋白质(如球蛋白)比分子量小的(如清蛋白)易于析出。球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中即可析出，而清蛋白需在饱和硫酸铵溶液中才能析出。(2)实验方法①取鸡蛋清约2mI于试管中，加等体积的饱和