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* （五）鉴定 1．纯度鉴定 基本手段：电泳分析，超离心法：单条带。 N端测定：n亚基蛋白有n个N端aa。 选用手段：沉降分析、溶解度分析、 结晶分析（能结晶的一般比较纯，具有活性） 还有恒溶度法分析 化学组成法测定最低分子量 SDS法 凝胶过滤法 渗透压法 扩散系数法 沉降系数法和沉降平衡法 2 蛋白质的分子量大小测定 如肌红蛋白含0.335%的铁， Fe分子量55.8 最小M＝ ×100＝ ×100 ＝16700 Fe分子量 Fe(%) 55.8 0.335 1）根据分子组成测定最低分子量 血红蛋白含0.335%的铁，Fe分子量55.8 血红蛋白的实际分子量是 66800（＝ 16700 × 4） 2） SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） 带电物质在电场中迁移的速度受什么影响？ 电荷多少 分子大小 形状 加入SDS和巯基乙醇 ？ SDS （十二烷基硫酸钠） －－－sodium dodecyl sulfate 使用去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）和还原剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸3～5分钟），通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。 同时还原剂可以切断蛋白质中的任何一个二硫键（使二硫键还原）。 经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连接的，分离的状态。 SDS 是一种阴离子去污剂，带有很多负电荷。与蛋白质结合以后，使蛋白质分子带有足够的负电荷，远远超过了蛋白质分子原有的电荷，蛋白质分子原有的电荷就变得无足轻重了。 SDS是一种变性剂，与蛋白质结合，改变了蛋白质单体分子的形状，均变成长椭圆棒状。所以在电场上移动的速度完全取决于蛋白质分子的大小。 注意：SDS－PAGE是将蛋白质解离成亚基，所以测出的分子量是亚基的分子量。 3）沉降分析法 沉降速度：指离心时，蛋白质分子在单位时间内下沉的距离。 沉降常数（沉降系数）：当沉降界面以恒速移动时，单位离心场中的沉降速度。 S：沉降常数 v：沉降速度（cm/sec） w：离心机转头的角速度（弧度/sec） x：蛋白质界面中点离旋转中心的距离， 以cm计。 沉降的速度与颗粒的重 量、密度和形状有关。 离心后按其沉降的速度不 同，彼此分开形成区带。 再进行光学定位，针刺或 冰冻切片采样分析。 蔗糖密度梯度 聚蔗糖密度梯度 氯化铯密度剃度离心 沉降系数: 把10-13秒作为一个单位，称为斯维得贝格单位，或沉降系数单位，用S（大写）表示。 瑞典的蛋白质化学家T.Svedberg 1S=10-13 M = —————— RTS D（1－Vρ） R——气体常数（8.314×107ergs·mol -1 ·度-1） T——绝对温度 D——扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机转速很快，则忽略不计） V——蛋白质的微分比容（m3·g-1） ρ——溶剂密度（20℃，g·ml-1） S——沉降系数 蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系 3．等电点的测定 4．生物活性的测定 不同的蛋白质有不同的生物功能，也就有不同的生物活性测定的方法。 （六）含量测定 总蛋白含量分析： 凯氏定氮法、Folin-酚法（Lowry法）、双缩脲法、考马斯亮蓝法、紫外吸收法。 特定蛋白组分的含量分析： 酶和激素等：酶活性或激素活性表示 其它蛋白：抗原抗体反应(western blot) 说明双向电泳分离蛋白质的技术原理及其在蛋白质组学研究中的重要意义 西北大学 05年 双向电泳（two-dimensional electrophoresis）　　如果将等电聚焦电泳与SDS结合起来，就是分辨率更高的一种双向电泳了。双向电泳后的凝胶经染色，蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质分开。 某种溶液中含有三种三肽：Tyr - Arg - Ser , Glu - Met - Phe 和Asp - Pro - Lys , α- COOH基团的pKa 为3.8; α-NH3基团的pKa为8.5。在哪种pH（2.0,6.0或13.0）下，通过电泳分离这三种多肽的效果最好？ 下列试剂和酶常用于蛋白质化学的研究中： CNBr ;异硫氰酸苯酯; 丹黄酰氯；脲; 6mol/LHCl ;β-巯基乙醇 ;水合茚三酮 ;过甲酸 ;胰蛋白酶;