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目的基因的导入和鉴定 背景知识简要介绍： 基因工程的定义：基因工程又称重组DNA技术，是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序。 基因工程的原理：是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品核酸凝胶电泳技术核酸分子杂交技术细菌转化转染技术 　　DNA序列分析技术寡核苷酸合成技术基因定点突变技术聚合酶链反应技术 图-1 基因工程的技术路线图 本实验主要内容包括了重组DNA导入宿主细胞、重组子的筛选、阳性重组子的验证。本实验已将目的基因bcl-2与含有氨苄青霉素的抗药基因(Ampr)的载体进行了DNA重组。 实验目的： 1、掌握热击法转化 E.coli 的原理和方法外源 DNA 与载体分子的连接即为 DNA 重组技术，这样重新组合的 DNA 分子叫做重组子。将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过筛选法筛选出重组子，并可通过酶切 本次实验所用的Bcl-2重组质粒含有氨苄青霉素的抗药基因(Ampr) 。故只有当Bcl-2重组质粒转入到细菌细胞内，细菌才具有抗Amp的特性（即细菌能在含Amp的培养板上生存并形成菌落）。 图-2 目的DNA重组、转化及筛选示意图 2、碱裂解法分离质粒DNA的原理 碱裂解法抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH 12.6的条件下，染色体DNA和质粒DNA都发生变性，但质粒DNA超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的KAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 碱裂解法中一些试剂的作用原理： 葡萄糖：增加溶液的粘度,维持渗透压,防止DNA受机械剪切力而降解 EDTA ：螯合Mg2+,Ca2+,抑制DNase;有利于溶菌酶作用(低离子环境) 溶菌酶：溶菌,但pH8.0该酶受抑制 NaOH ：核酸在pH5～9稳定,但在pH12或3则变性, 溶液II中pH为12.6, 可使染色 体和质粒DNA变性 SDS：离子型表面活性剂 溶解细胞壁上的脂质与蛋白,破坏细胞壁 解聚胞中的核蛋白 与蛋白质结合成复合物,使蛋白变性沉淀 抑制RNase,下一步需除去 KAc-HAc缓冲液(pH4.8)： 把pH12.6的抽提液调回pH至中性,使变性的质粒DNA复性,并稳定存在,而高盐的KAc有利于变性的染色体DNA、高分子量RNA、和K+-SDS-蛋白质-细胞壁复合物凝聚而沉淀。 限制性核酸内切酶酶切原理 限制性核酸内切酶由细菌自身产生，能识别双链DNA分子中特定的碱基顺序，以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键，产生粘性末端或平头末端。 图-3 EcoR I的作用模式图 图-4 Bcl-2重组质粒的酶切模式 实验材料： Bcl-2基因重组质粒，感受态DH5α细菌（均由广东医学院分子生化教研室供） 实验器材： 超净工作台、培养箱、、水浴箱、恒温摇床、微波炉、低温高速离心机、水平式凝胶电泳槽、稳压稳流电泳仪、紫外透射仪、微量离心机、冰箱、培养皿、微量加样枪、枪头、EP管、酒精灯、火柴。 实验试剂： LB液体培养基、Amp琼脂板、碱裂解溶液I（50mmol/L葡萄糖、10mmol/L EDTA、25mmol/LTris(pH8.0)、2g/ml 溶菌酶(临用前加)）、碱裂解溶液II(临用时配制)（0.2 mol/L NaOH、1% SDS）、碱裂解溶液III（29.4g KAc、11.5ml HAc、加ddH2O至100ml）、无水乙醇、TE缓冲液、无菌ddH2O、10×buffer H(含BSA)、8U/ul EcoRI、聚丙烯酰胺凝胶、核酸染料、上样buffer、DNA Marker。 实验步骤： 1、重