基于PCR染色体步查技术课件.ppt

基于PCR的染色体步查技术;染色体步查(Chromosome walking) 是指由生物基因组或基因组文库中的已知序列出发,逐步探知其旁邻的未知序列或与已知序列呈线性关系的目的序列的核苷酸组成的方法和过程。 ;基于PCR的染色体步查技术;利用载体或接头的PCR技术 这类方法的第一步通常都是酶切基因组DNA，连接载体或接头,以提供PCR需要的另一端引物. 利用载体的PCR 利用接头的PCR 寡聚盒介导的PCR 环状PCR I-PCR(Inverse PCR) P-PCR(Panhandle PCR) ;利用载体的PCR 1989年，Shyamala等利用单特异引物PCR(single specific primer PCR, SSP—PCR)以小鼠伤寒杆菌组氨酸转运操纵子为起点进行连续步查。用PstI+ AraIM酶切基因组DNA，PstI+XmaI酶切载体DNA,然后连接基因组片段和载体片段，用根据基因组DNA序列设计的特异引物和载体的通用引物进行扩增. 由于非特异片段没有特异引物的结合位点,即使有载体连接到非特异片段，它也不能得到大量扩增，而使特异片段得到有效扩增。 在这种方法中，如果用合适的接头代替载体效果也会一样。这种方法原理简单，实验设计简便，但操作较为繁琐，特异性较低，即使用嵌套引物扩增也往往会造成非特异性扩增，产物仍需杂交进一步确定。之后出现了一些方法利用不同的技术增强PCR的特异性。;利用接头的PCR 1995年，Siebert结合Vectorette PCR和Suppression PCR设计改进了利用接头的PCR 。;(1)选择合适的酶切位点酶切总基因组；; (4)vectorette’ 接头由一条长链和一条短链组成; 短链3‘端用-NH2封闭,使接头中的短链不会在PCR开始时自身延长; 在第一个延伸反应中,接头引物无模板配对,只有特异引物起作用延伸出一条单链; 在第二个延伸反应中,接头引物才能以第一个反应中延伸出的单链为模板开始扩增.;Gel electrophoresis analysis of the representative PCR products derived from L. borgpetersenii genomic DNA. The PCR walking templates were prepared from EcoRV-digested DNA or from PvuII digested L. borgpetersenii genomic DNA. Lane 1, DNA marker; lane 2, primary PCR products from primers AP1 and P12; lane 3, secondary PCR products from primers AP2 and P13. The arrow indicates the PCR fragment that was cloned for sequencing.;;A,B,C EcoRI酶切基因组的扩增产物 D,E,F HindIII酶切基因组的扩增产物 A,D 只加接头引物 B,C,E,F 不同的特异引物和接头引物;寡聚盒介导的PCR 寡聚盒介导PCR是利用双链接头进行染色体步行的方法，为了增加反应的特异性他们在一个特异引物上增加了便于选择特异产物的生物素标记。 寡聚盒介导PCR在第一次PCR反应中用带有生物素标记的特异引物进行单引物PCR，合成含有目的序列和接头序列的单链DNA产物，而后用链霉亲和素覆盖的磁珠在反应混合物中捕捉分离带有生物素标记的单链产物，以回收的单链产物为模板用无标记的嵌套特异引物和接头引物进行第二次PCR扩增，终产物纯化后直接进行测序。由于在特异引物上增加了有利于选择特异产物的生物素标记，这种技术的特异性比较高。;环状PCR 环状PCR是能够根据已知序列设计两对嵌套PCR引物进行染色体步行的方法。 包括I-PCR(Inverse PCR) P-PCR(Panhandle PCR) I-PCR与P-PCR的不同之处在于前者用DNA连接酶使酶切片段自连产生环状模板，而后者则利用末端反向重复序列与已知序列互补配对形成环状单链模板。;I-PCR (Inverse PCR) : 基因组DNA经酶切后自连成环状分子; 再用另外一种限制性内切酶在已知序列处切开，又成线状DNA; 根据两端序列设计引物进行PCR扩增。 I-PCR被用于从酵母基因组DNA中分离YAC克隆末端，也被成功的应用于从植物基因组DNA中分离转座子侧翼的特异区域