细胞工程学 第3章.ppt

2、培养细胞的分化 细胞分化机制极其复杂，是在细胞与细胞、细胞与体液、细胞与细胞外基质相互作用下，由众多基因参与、经过多阶段和多环节完成的动态演变过程。 细胞离体培养，因环境改变，失掉上述在体内时的关系，细胞的分化就可能发生变化。 不适应： 不适应表现为细胞在原体内时所拥有的分化特性减弱或不显，如肝细胞产生酪氨酸转移酶特性的丧失。培养细胞分化的改变，主要因环境改变所致。 脱分化或去分化： 细胞出现脱分化或去分化，就是细胞失掉发生分化的能力。仍以肝细胞为例，当肝细胞失掉产生精氨酸酶、氨基转移酶等特性后，则失掉贮存肝糖原能力，并很难再现。 与体内条件越近似时，细胞愈易发生分化。 细胞离体培养时间越长，分化能力越差，培养细胞在体外生存时间与其分化能力呈反向关系。 二、培养细胞的形态分类 1、贴附型 只依赖于贴附才能生长的细胞称贴附性细胞或锚着依存性细胞。 （1）成纤维型细胞 皮肤成纤维细胞（ 100 倍） 成纤维型细胞，细胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质向外伸出2～3个长短不同的突起。细胞在生长时多呈放射状、火焰状或旋涡状走行。在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维细胞。 （2）上皮型细胞 培养的血管内皮细胞 3、游走型细胞 游走型细胞在支持物上散在生长，一般不连接成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快而且不规则。此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞相区别。在一定条件下，由于细胞密度增大联接成片后，可呈类似多角形。 （4）多形型细胞 除上述三型贴附型细胞外，还有一些组织和细胞，如神经组织的细胞等，难以确定它们规律的形态，可统归入多形型细胞。 2、悬浮型 有的细胞在培养时不贴附于支持物上，而呈悬浮状态生长，如某些癌细胞和血液白细胞可呈悬浮型。 细胞悬浮生长时，胞体为圆形，观察时不如贴附型方便。但优点是细胞悬浮在培养液中生长，生存空间大，允许长时间生长，能繁殖多量细胞，便于做细胞代谢等研究。 三、培养细胞的生长和 增殖过程 细胞在体外培养后，在一切条件适宜的情况下，最主要的活动是生长和增殖。 细胞生长：细胞体积增大。 细胞增殖：细胞数量增多。 1、培养细胞的生命周期 组织培养细胞生命周期指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本相一致。 进行正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞全生存过程中，大致都经历以下三个阶段： 原代培养期 传代期 衰退期 2、培养细胞的一代生存期 细胞“一代” 仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代或倍增一代不同；细胞世代是指细胞的生命周期。而在细胞的一代中，细胞能倍增5～6次。 细胞传一代，一般要经过以下三个阶段： 潜伏期 指数增长期 停滞期 培养细胞的生长曲线 3、细胞周期 一个细胞周期是从一次细胞分裂结束开始，经过物质积累过程，直到下一次细胞分裂结束为止，这种细胞物质积累和细胞分裂的循环过程，称为细胞周期。 细胞周期分为细胞间期和细胞分裂期两个阶段。 4. 细胞系的生长过程 细胞系在培养中能够存活时间的长短，主要取决于细胞来自何种动物种族及年龄。不同的细胞体外培养可传代数不同，当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶习性转化时，细胞的生存期可能发生改变。 人胚二倍体成纤维细胞培养，在不冻存和反复传代条件下，可传30～50代，相当于150～300个细胞增殖周期，能维持1年左右的生存时间。 恒河猴的皮肤成纤维细胞能传40代；鸡胚胎成纤维细胞最多能传30代；小鼠成纤维细胞只能传8代左右；如供体为成体或衰老个体，则生存时间更短；如培养的肝细胞或肾细胞，仅能传几代或几十代。 体外培养条件可能延迟细胞衰老，寿命从50代延至150代。当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶习性转化时，细胞的生存期可能发生改变。 影响群落形成效率的因素 （1）接种的细胞密度与群落的形成率的相关性 接种的细胞密度与群落的形成的关系 接种细胞密度与群落形成的关系 期待的群落形成率 接种细胞的最适数目 1ml中 1cm3上 0.10% 104 2×103 1.00% 103 200 10% 100 20 50% 20 4 100% 10 2 （2）培养液 最适的克隆化培养液需通过选择性培养来选定，选群落形成效率比较高的培养液，Ham氏的F12培养液被证明是最好的克隆化培养液，可适用于许多细胞类型。