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* * (一) 分析方法的选择 HPLC, GC HPLC-MSn, GC-MS RIA, EIA, FIA; 适用于大分子 TDM应用较多 抗生素生物利用度, 等效性, TDM 应用较少 常用的检测方法: 色谱分析法, 免疫分析法 和生物学方法 * * (二) 分析方法建立的一般程序 待测物,内标(必要时)的标准物质 色谱柱(填料),流动相,溶剂,进样量 试剂/溶剂试验; 生物介质试验 质控样品试验 代谢产物对待测物,内标物的干扰 配伍用药的干扰 分析方法的建立和验证过程系同步进行 为便于讨论, 以色谱分析法为例分别叙述 1. 色谱条件 的筛选 2. 色谱条件 的优化 3. 实际样品 的测试 * * 二、分析方法的验证 特异性 标准曲线与定量范围 定量下限 (一) (二) (三) 精密度与准确度 (四) 样品稳定性 (五) 提取回收率 (六) 方法 样品 * * 二、分析方法的验证 分析过程的质量控制 未知样品浓度超限的处理 药用内源性物质的测定 (七) (八) (九) 微生物/免疫学方法的验证 (十) 名词解释 (十一) 分析 其他 * * (一) 特异性 比较标准物质与6个不同个体的空白生物介质和QC样品 软电离质谱(LC-MS)介质效应 比较QC样品和至少6个不同个体用药后的实际样品 必要时LC-DAD/MS确证峰的单一/同一 比较待测药物, 同服药物,待测药物的QC样品和添加有同服药物的干扰样品 特异性(specificity), 又称专属性或专一性, 通常与选择性(selectivity)互用 1.内源性物质 2.未知代谢物 3.伍用药物 4.参比方法 参比方法横坐标(x), 拟定方法纵坐标(y), 最小二乘 y=a+bx a恒定干扰 b比例干扰(如, 标记抗原不纯, 交叉免疫) * * (二) 标准曲线与定量范围 1. 标准曲线的建立 (二) 少数方法(如,IA)外, 通常为线性模式 线性回归: 最小二乘法或加权最小二乘法 自变量(x)为药物浓度, 因变量(y)为响应信号强度 (1) 系列标准溶液: n≥6(不包括0点); 等比系列(2~3); 通常为100~1000倍 (2) 内标溶液: 浓度相当于系列标准溶液的几何平均浓度 (3) 系列标准样品: 空白生物介质, 加入系列标准溶液 (4) 标准曲线的绘制: 药物浓度, 以单位体积(如血浆)或质量(如肝脏)的生物介质中加入标准物质的量表示 * * (二) 标准曲线与定量范围 2. 限度要求 通常用至少6个浓度建立标准曲线 非线性相关(如IA)可能需要更多浓度点 定量范围覆盖全部待测样品浓度范围 定量上限(ULOQ)高于用药后的峰浓度(Cmax) 定量下限(LLOQ)低于Cmax的10%~5%(1/10~1/20) 标准曲线各浓度点的回归计算值(x’)与标示值(x)之间的偏差〔bias=[(x’-x)/x]×100%〕在可接受的范围之内 最低浓度点的偏差在±20%以内 其余浓度点的偏差在±15%以内 * * (三) 定量下限 1. 测定法 取同一生物介质,制备至少5个独立的标准样品,其浓度应使信噪比(S/N)大于5,依法进行精密度与准确度验证 定量下限(LLOQ): 标准曲线上的最低浓度点 符合准确度和精密度要求 2. 限度要求 准确度应在标示浓度的80%~120%范围内,相对标准差(RSD)应小于20% * * (四) 精密度与准确度 1. 测定法 高中低3个浓度的QC样品, 制备至少5个独立的样品 低:LLOQ的2~3倍;高:ULOQ的80%; 中:几何平均浓度 同法独立测定3天 方法精密度除评价批内(日内)RSD外, 同时还应评价 批间(日间)RSD 2. 限度要求 准确度: 低,80%~120%; 中高, 85%~115% RSD: 低,20%; 中高, 15% * * (五) 稳定性 1. 测定法(高低浓度) 室温考察1个工作日(如1,2,4,8或24h) 冷藏(4℃)数个工作日(标准储备液至整个分析完成) 冷冻(-20℃/-80℃)至整个分析完成 冻-融至少经历3个循环 短期稳定性: 在1个分析批内,样品室温等待处理; 处理后溶液在特定(HPLC进室)温度等待进样期间稳定性 长期稳定性: 在整个样品分析期间, 体内样品的长期储藏, 冻融; 以及标准储备液的稳定性 2. 期限要求 短期: 通常1工作日, 不超过3工作日; 长期: 整个分析完成期限 * * (六) 提取回收率 1. 测定法 高中低3个浓度的QC样品, 制备至少5个独立的样品 另取空白生物介质,照QC样品同法处理,加入等量