癌细胞微环境中蛋白质因子的功能与调控.docVIP

项目名称： 癌细胞微环境中蛋白质因子的功能与调控 李鲁远 南开大学 2011.1至2013.8 天津市科委 教育部   二、研究内容和课题设置的调整 项目研究内容具体调整方案分课题简述如下： 课题一： 1）进一步研究VEGI抑制内皮祖细胞的分化以及抑制EPC支持的肿瘤血管发育和生长的机理。内皮祖细胞（EPC）在肿瘤血管新生过程中发挥重要作用。VEGI已被证明可以通过诱导凋亡抑制内皮细胞生长。我们发现，VEGI能够明显抑制小鼠骨髓来源的EPC（Sca1+单核细胞）的分化过程。经过VEGI处理的EPC细胞，内皮细胞标志物水平明显下降，而干细胞标志物水平保持不变，并且在VEGI刺激后，细胞粘附、侵袭及血管形成能力均降低。VEGI还能诱导增殖状态的EPC而非静息态的EPC发生凋亡。早期EPC经VEGI刺激后，细胞内磷酸化Erk水平升高，而磷酸化Akt水平降低；而晚期或分化的EPC在VEGI的作用下NF-κB、JNK及Caspase-3信号通路的活化水平都有相应升高。同时我们发现，VEGI诱导晚期EPC的凋亡，可能部分是通过死亡受体3（DR3）实现的，因为后者仅在晚期EPC上被检测到。使用DR3的中和抗体或重组的细胞外DR3结构域能够显著抑制VEGI引起的凋亡过程。上述结果表明，VEGI可能通过抑制EPC的分化参与调节血管新生过程。 我们还发现，在众多参与免疫调节的细胞因子中，IFNγ能够在脐静脉内皮细胞中以时间/剂量依赖的方式下调VEGI的表达，使用IFNγ受体1的中和抗体可以恢复VEGI的表达水平。IFNγ调节VEGI更多的是通过非磷酸化的STAT1而不是磷酸化的STAT1实现。上述结果表明，IFNγ下调内皮细胞中VEGI的基因表达水平对于炎症引起的血管新生的起始及进程十分重要。 在临床研究方面，我们发现，下调VEGI的表达是卵巢癌形成过程中的重要事件。在正常及癌变的卵巢组织里，随着癌症临床分级的增加，VEGI的表达水平明显下降。VEGI的表达水平与瘤内血管密度或T细胞浸润之间表现出负相关性。我们认为，VEGI作为一种重要的血管生长抑制因子，参与机体血管系统的稳态调节，在病理或生理状态的血管新生过程发生之前，其表达水平被提前下调。看来，这个下调过程由卵巢癌细胞产生的VEGF以及肿瘤浸润型T细胞产生的IFNγ介导。这些结果表明，VEGI对于卵巢癌的癌变过程十分重要。 2） 进一步研究VEGI是否能够抑制EPC支持的肿瘤血管发育和生长。我们研究了VEGI抑制骨髓来源的内皮祖细胞进入小鼠肺癌肿瘤的机理。骨髓来源的内皮祖细胞对于肿瘤部位的血管新生有重要的支撑作用。我们发现，在多种癌症及血管新生模型中，重组的人血管内皮生长抑制因子VEGI可以通过特异性减少肿瘤血管部位的成熟内皮细胞数量抑制血管新生及肿瘤生长。我们最近发现，VEGI能够显著降低肿瘤部位EPC的含量。我们将来自绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠的全骨髓移植到C57BL/6受体鼠内，随后，向该小鼠接种LLC肺癌细胞，并使用VEGI或对照缓冲液刺激。我们发现，与对照组相比，VEGI处理的小鼠，肿瘤生长速度明显放缓，且肿瘤内部CD31+血管密度明显降低。对肿瘤小鼠外周血进行流式分析结果显示，在进入肿瘤组织之前，骨髓来源的EPC细胞（GFP+/Flk+）数量有明显增加，随后，外周血中EPC数量显著降低。我们通过GFP+/CD31+免疫染色监测EPC行为发现，VEGI处理后的小鼠中，肿瘤部位的EPC数量明显少于对照组，同时，进入肿瘤血管部位的EPC数量也明显少于对照组。使用TUNEL对肿瘤组织进行凋亡检测显示，VEGI处理后的小鼠肿瘤部位EPC细胞凋亡水平明显升高。上述结果表明，VEGI在调节EPC向LLC肿瘤部位侵入的过程中发挥重要作用，并由此抑制肿瘤新生血管形成进而抑制肿瘤生长。 3）研究人类基因RHBDF1是否通过对缺氧诱导因子HIF1alpha蛋白稳定性的调控促进癌变和癌细胞转移。我们在研究肿瘤血管生长调控机理时，发现了一个新的人类基因：rhomboid family-1 (RHBDF1)。Rhomboid 家族基因在各个物种广泛存在，有重要的生物学功能，但 RHBDF1 的功能基本未知。我们发现 RHBDF1参与了EGFR信号激活。上皮生长因子受体（EGFR）是一种在众多癌症中被激活的癌基因。它能被G蛋白偶联受体（GPCR）的配体激活。我们发现，在头颈癌细胞系1483中使用siRNA沉默RHBDF1基因能够抑制GRP诱导的EGFR磷酸化以及EGFR依赖的p44/42 MAPK及AKT信号通路的激活，同时GRP引起的细胞存活、增殖及侵袭能力的提高也受到显著削弱。在上述情况下，EGFR信号通路依然保持完整，细胞对外源EGF具有正常的应答反应。这些结果表明RHBD