双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作用研究中的应用进展.docVIP

　　双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作用研究中的应用进展 【关键词】 双分子荧光互补（BiFC）；互补片段；荧光复合物；蛋白质相互作用 Abstract：Bimolecular fluorescence plementation (BiFC) means tentary fragments of fluorescent protein can reassemble to form fluorescent plex and restore fluorescence ong a any cell types. In this paper, the principle and characteristics of BiFC，the application advances, the limitation and future prospects of BiFC assays are described. Key olecular fluorescence plementation(BiFC)；plementary fragments；Fluorescent plex；Protein-protein interactions 1 引 言 蛋白质相互作用和翻译后修饰的研究使人们对生物调控机制的认识取得了巨大的进展，蛋白质相互作用的研究方法也备受重视，出现了许多具有不同原理和应用特点的相关技术和方法［1-2］。BiFC作为一种用于研究蛋白质间相互作用的新型方法引起了人们的关注。利用BiFC分析能够在活细胞生理环境中原位显示蛋白质相互作用产物，尤其是能在单细胞中同时显示多个蛋白质间的相互作用。近年来，基于BiFC原理的分析方法在蛋白质相互作用和翻译后修饰的研究中逐渐显现出其独特的应用价值。 2 BiFC概述 2.1 BiFC原理 　　GFP及其突变体作为能够在活体中表达且易于检测的报告基因［3］，通常是以完整的氨基酸序列作为标记物。随着对其结构和功能研究的日益深入，不断发掘一些新的特点，如GFP基酸序列中的某些特定位点与氨基末端以及羧基末端之间的序列循环互换后仍然能够正确折叠形成生色团结构并保持荧光特性［4-5］。Hu CD等通过进一步研究发现［6］，在GFP及其突变体氨基酸序列的155或173位点，将其分裂为均不具备发光性能的荧光蛋白片段，即氨基末端片段（含1-154或1-172氨基酸序列）和羧基末端片段（含155-238或173-238氨基酸序列），当某些特定的氨基末端片段与羧基末端片段组合作为标记分子分别与两个能够发生相互作用的蛋白质配偶体形成融合蛋白、并同时在活细胞中表达时，蛋白质配偶体的结合驱使氨基末端片段与羧基末端片段重新组装形成荧光复合物，恢复荧光效应［6-7］。这一现象称为双分子荧光互补（bimolecular fluorescence plementation，BiFC），能产生BiFC效应的氨基末端片段与羧基末端片段称为互补片段。 　　 2.2 BiFC的特性 2.2.1 荧光蛋白片段的互补特性 按照不同的分裂位点，每个荧光蛋白可产生两个氨基末端片段和两个羧基末端片段，分别以N155、N173和C155、C173表示。BiFC可发生于同一荧光蛋白的氨基末端片段与羧基末端片段之间，如EYFP的N155和C155、N173和C173，也能发生于不同荧光蛋白的氨基末端片段与羧基末端片段之间，如GFP的N173和EYFP的C173、EYFP的N173和ECFP的C155。某些荧光蛋白片段具有多重互补特性，能够与两种以上其它片段互补，如EYFP的N173能够与EYFP的C173、C155和ECFP的C155形成荧光复合物。但并非所有的荧光蛋白的氨基末端片段与羧基末端片段之间都能产生互补，至今尚未观察到GFP的氨基末端片段与羧基末端片段能形成荧光复合物［8］。 2.2.2 BiFC的光谱特性 荧光蛋白的三肽生色团结构（65-67位氨基酸）位于氨基末端片段内，双分子荧光复合物的光谱特性主要取决于氨基末端片段。于同一荧光蛋白的互补片段形成的荧光复合物的激发光谱和发射光谱与对应的完整的荧光蛋白光谱一致，在某些情况下有红移现象发生，这可能与互补片段组装过程中生色团周围的氨基酸排列产生一定改变有关［9］。于不同荧光蛋白的互补片段形成的双分子荧光复合物的激发光谱和发射光谱介于其的两种荧光蛋白光谱之间，与氨基末端片段的荧光蛋白光谱接近。总之，相对于天然荧光蛋白，双分子荧光复合物的荧光强度有不同程度的减弱。 2.3 互补片段的研究进展 　　自BiFC发现以来，最早确认的12种互补片段组合于EGFP、EYFP、ECFP［7］，分属7个不同的光谱类型。这些互补片段标记的融合蛋白载体转染细胞并稳定表达后，必须在低温下（