发酵黄芪对BALB-C小鼠免疫功能及细胞因子的作用.doc

　　发酵黄芪对BALB/C小鼠免疫功能及细胞因子的作用 ：王晓波，刘殿武2，郭丽莉，王本华 【摘要】 目的研究发酵黄芪对小鼠免疫功能及细胞因子的影响。方法将小鼠随机分成正常对照组、免疫抑制组、黄芪对照组和发酵黄芪低、中、高3个剂量组(剂量分别为 1，2， 5 g/kg)，饮水法喂饲小鼠，分别检测以下指标: 小鼠胸腺和脾脏指数，淋巴细胞亚群，淋巴细胞增殖功能，腹腔巨噬细胞吞噬功能、IL-1、IL-2分泌。结果与免疫抑制对照组比较，发酵黄芪高、中剂量能显著促进淋巴细胞的转化，使CD3、CD4 、CD4/CD8明显上调，促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力，促进白介素-1(IL-1)和白介素-2(IL-2)的产生(P均lt;0.05)。结论发酵黄芪能提高机体的免疫功能，其作用机制与激活T细胞、T淋巴细胞亚群、巨噬细胞功能及促进细胞因子分泌有关。 【关键词】 发酵黄芪; 免疫功能; 细胞因子; 小鼠 　黄芪作为常用的补益类中药，具有补气固表及健脾利肺的功效。目前国内外 现代 研究也已证实，黄芪含有多糖、苷类、生物碱、黄酮、微量元素及其氨基酸等成分具有调节机体免疫功能的作用[1，2]。为了进一步开发传统的中药剂型，研究发酵黄芪对小鼠免疫系统及功能的作用，对传统中药的二次开发提供理论及应用的可行性依据。 　　 1 材料与仪器 　　1.1 动物及细胞株健康BALB/C小鼠，雌雄各半7～8周龄，体质量18 ～22 g，由河北医科大学实验动物中心提供;C57BL/6，雌性体质量18～20 g，一级动物，合格证号：冀医动字第04035号。 　　1.2 药品与试剂发酵黄芪由保定生物公司提供。RPMI-1640培养基、小牛血清：美国GIBCO公司;胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)、刀豆蛋白(ConA)为Sigma公司产品。 抗Thy1、2;抗LST4、抗 Lyt2美国FLUKA公司;环磷酰胺，上海第二制药厂制造，(CycloPhosPhamide， CP)。二甲基亚砜(DMSO)购于上海化学试剂公司，其余试剂均为分析纯。 　　1.3 仪器倒置显微镜(PM-10AD)，OLYMOUS日本。二氧化碳孵箱(TC2323，美国SHEL.LAB公司);酶标仪(奥地利公司)。流式细胞仪，美国(FACS-420)。 　　2 方法 　　2.1 动物分组处理与给药BALB/C小鼠随机分成6组，每组7只动物，分别为生理盐水对照组、环磷酰胺组、黄芪对照组、发酵黄芪小剂量组(1 g/kg)、中剂量组(2 g/kg)和高剂量组(5 g/kg)。黄芪组(1 g/kg)每天每只灌服0.5 ml，对照组灌服等量生理盐水。环磷酰胺组ip给药连续3 d造模。第8天各组颈椎脱臼处死小鼠，无菌取胸腺、脾测定。 　　2.2 脏器/体重比值测定实验结束，称质量、胸腺重、脾重，取小鼠脾脏和胸腺称重(湿重)， 计算 脏器指数(%)=脏器重量(g)/动物质量(g)×100%。 　　2.3 小鼠脾细胞悬液的制备及脾淋巴细胞活力的检测采用MTT法[3] 小鼠分组与喂饲方法同上。 无菌取脾，经过研磨200目细胞筛网过滤、经常规裂解红细胞，hanks液洗涤，离心2次，制得单细胞悬液，最后用含10%小牛血清RPMI-1640调细胞浓度5×106个/ml，接种于96孔板(100 μl/孔)，每组6个平行孔，每孔100 μl。37℃保湿培养68 h后，每孔加MTT 10 μl，继续培养4 h后，每孔加入DMSO 150 μl，振荡5 min，紫色结晶完全溶解后于酶标仪570 nm测定A值。 　　2.4 小鼠脾细胞亚群测定(流式细胞仪)[4]将6～8周龄、体质量(20±2) g BALB/C雌性小鼠随机分成6组，每组6只。无菌取小鼠胸腺细胞，4%甲醛固定，预冷PBS清洗，加入荧光标记的CD3、CD4、CD8单克隆抗体50 μl，37 ℃ 30 min， 1 000 r/min离心10 min，加入荧光标记的二抗工作液50 μl，37 ℃ 30 min，RNase消化，1ml碘化丙啶，每份样本平均测定1×104个，分析相应阳性细胞的含量。 　　2.5 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能测定[5] 小鼠分组与喂饲方法同上。按常规制备小鼠腹腔巨噬细胞，置24孔培养板每孔加细胞悬液1 ml，5% CO2，37 ℃ 培养2 h，去上清液，用RPMI 1640培养液洗去未贴壁细胞，每孔加入0.1%中性红生理盐水液1ml，5% CO2，37℃培养2 h后，甩弃中性红，并用预温的BPS清洗未吸收的中性红，吸水纸吸干，每孔加入细胞裂解液1 ml，静置4 ℃ 过夜，用蒸馏水调零，于722分光光度计550 nm处测定吸光度A值，A值表示巨噬细胞吞噬功能的强弱。 　　2.6 腹腔巨噬细胞产生IL-1的诱生及测定[5]小鼠分组与喂饲方法同上。将2