小鼠卵巢自体移植后血管重建及移植部位血管密度的实验观察.doc

　　小鼠卵巢自体移植后血管重建及移植部位血管密度的实验观察 ：孙静， 党玲 王燕蓉， 贺晓亮， 崔 岫， 沈新生 朱万平 【摘要】 目的 观察小鼠卵巢自体异位移植物与受体移植部位的血供重建时间及移植部位血管密度对移植物存活的影响。方法 成年小鼠卵巢剥膜后一分为二，体外培养3h后进行半卵巢自体异位移植于肾被膜下和颈部皮下，实验分为新鲜组、肾背膜下移植组、颈部皮下移植组，于移植后 36 h取材，通过墨汁灌注和组织切片技术，观察卵巢移植后血管重建及卵泡存活情况。结果 肾被膜下移植组可见有贯穿肾组织至卵巢组织之间的血管，正常卵泡计数较多，与颈部皮下移植组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。肾组织血管密度明显大于颈部皮下组织(P＜0.05)。结论 富含血管的肾被膜下移植较血管较少的颈部皮下移植更有利于卵巢组织移植后的血供重建。 【关键词】 半卵巢；自体移植；小鼠；血供建立 卵巢冻存后移植为恢复女性因癌症 治疗 而丧失的卵巢功能提供了一个可选择的途径，然而有研究表明，在冻融过程中大约有7％的卵泡丢失，而在移植后血管再生过程中有约65％的卵泡丢失［1］。因此找到一种既有利于血管生长、避免缺血损伤，又有利于卵泡发育的办法十分必要。目前常用于观察血管生长的方法是通过免疫组织化学的方法观察血管内皮细胞，该方法操作繁琐，费用较高，耗时较长。为了观察卵巢移植后血管由受体移植部位进入移植物的真实状况、比较不同移植部位血管密度对移植物存活的影响，我们以成年小鼠为实验对象，采用简易的墨汁灌注法观察移植后血供建立的状况。 1 材料与方法 1.1 实验动物及分组 昆明种属雌性小白鼠，由宁夏医科大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK(宁2005-001)，体重(20±2)g；将小白鼠随机分为①对照组(control group，CG)，8只；②肾被膜下移植组(kindey capsule transplantation group，KTG)，8只；③颈部皮下移植组(neck subcutaneous tissue transplantation group，NTG)，8只。 1.2 实验用液体 培养用液DMEM+F12+10%FCS作为基液配制，墨汁灌注液的配制如下：中华牌墨汁∶PBS∶30％甲醛为4∶5∶1，灌注液中同时含0.5％肝素。 1.3 方法 1.3.1 移植方法 取动情间期昆明小鼠，用0.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(0.2mL/10g)。75%碘酒、酒精消毒背部皮肤，在左侧肋脊角处逐层切开单侧的皮肤和肌肉，暴露该侧卵巢，自输卵管处结扎卵巢动静脉，完整切除卵巢，剥去外膜后将卵巢一分为二，体外培养3h，待移植。 1.3.2 实验分组及处理方法 CG：右侧卵巢切除后进行固定、石蜡包埋、组织切片，HE染色。 KTG：切除右侧卵巢留作组织切片对照，充分暴露该侧肾脏，用显微手术镊轻轻提起肾脏被膜，用显微手术剪在肾脏上端将肾脏被膜剪开一个小口，将卵巢移入切口由肾脏上端轻柔地推向下端。由于肾脏被膜有一定的张力，组织放入后不需缝合被膜，将肾脏送回腹腔原位后，依次缝合手术切口。术后每只小鼠腹腔注射3～4万IU青霉素以防感染，移植术后36h取材。 NTG：切除右侧卵巢留作组织切片对照，消毒颈背部皮肤，用手术剪剪开约1.5mm的小口，钝性分离皮下组织，将培养卵巢放入小口内，缝合并留结扎线做记号，缝合皮肤，移植36h后取材。 1.3.3 取材方法 腹腔注射0.5%戊巴比妥钠(0.3mL/10g)麻醉小鼠后，逐层打开胸腔，将注射器于心尖部插入左心室内，在1min内匀速注射1.5～1.8mL灌注液。灌注的同时开窗右心耳，同时注意观察小鼠的眼、耳、口腔黏膜、趾端、尾巴。当它们均变黑时，证明灌注成功。停止灌注约2min后取材。 1.4 观察指标 光学显微镜下观察移植卵巢内有无墨汁并计数正常卵泡数及移植部位血管密度 1.4.1 组织切片观察 卵巢组织或器官制作成5μm石蜡切片，经苏木精-伊红(HE)染色后观察血管内有无墨汁、卵泡、卵母细胞和颗粒细胞的结构。 1.4.2 正常卵泡计数 每只小鼠随机取5张切片，每张切片随机选取3个高倍视野，HE染色后，光学显微镜下计数正常卵泡的数量。正常的卵泡为包含一个完整的卵母细胞和排列整齐的颗粒细胞层。相反，若卵母细胞核固缩、卵母细胞萎缩、颗粒层排列紊乱等出现一项就表明卵泡退化。 1.4.3 移植部位血管密度计数 每个标本随机取5张切片，每张切片随机选取3个高倍视野，光学显微镜下计数墨汁数量。因肾小球均显示墨汁灌注，故不 计算 在内。墨汁点、墨汁条均计算为血管， 1.5 统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件进行方差分析及t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。 2.2 不同组别小鼠存活卵泡情况