布地奈德吸入对支气管哮喘大鼠支气管Eos和STAT6表达的调控作用.doc

　　布地奈德吸入对支气管哮喘大鼠支气管Eos和STAT6表达的调控作用 【摘要】 目的 研究布地奈德(BUD)对支气管哮喘大鼠支气管Eos和STAT6表达的调控作用。方法 30只清洁级幼年健康雄性a公司（进口分装）；液态铝（Alum)美国PIERCE公司（批；布地奈德雾化液(BUD)澳大利亚阿斯利康公司（批；大鼠用STAT6免疫组化检测试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司。 1.2.3动物模型制作 （1）致敏及激发哮喘阶段：参考苗会、薛全福等[1]人的研究报道制作哮喘模型，模型组大鼠在实验第1天于腹腔注射致敏原（含0.01％OVA0.1ml及液态铝0.1ml，充分混匀30min），之后于实验第8天及第15天腹腔注射加强致敏，注射量相等，共2次。实验第22天起将大鼠置于自制45cm×30cm×25cm有机玻璃箱中雾化吸入1％OVA溶液4ml激发哮喘，每天一次，每次30min，持续7天。正常对照组用等量NS替代OVA。 （2）BUD干预阶段：布地奈德组大鼠同模型组致敏及激发，激发前30min给予0.2mgBUD雾化吸入，每天一次，每次30min，持续7天。模型组、正常对照组用等量NS代替，持续时间相等。 1.2.4动物处理 各组大鼠于最后一次雾化激发12小时以1000u/ml肝素0.2ml腹腔注射抗凝，1％戊巴比妥钠(30mg/Kg)腹腔注射麻醉，眼球放血、颈椎脱臼法处死大鼠，采集标本。 1.2.5试验指标采集与测定 （1）取血清：大鼠麻醉后用1000u/ml肝素0.2ml腹腔注射抗凝，用弯镊摘取双侧眼球取血约1ml，血液用低速离心机以2000r/min速度离心20min，取血清，-20℃保留，用ELISA法测定血清中IL-4水平。 （2）收集支气管肺泡灌洗液（BALF）：取血完毕后，即刻行气管插管左肺支气管肺泡灌洗生理盐水5ml×6,回收肺泡灌洗液(BALF),回收率gt;90%。取BALF回收液3ml经双层无菌纱布过滤,在4℃、1200 r/min离心10min分离细胞。离心沉淀细胞用生理盐水冲洗并调整细胞数为1.0×109/L,在细胞计数板上计数细胞总数。取已调整细胞数的BALF 30μL,用特制的细胞涂片离心支架在4℃、1200 r/min离心10 min,通过离心作用使一定量细胞均匀平铺于载玻片上,冷风吹干,经HE染色后在高倍镜下计数100个细胞,同时进行细胞分类计数,每例动物计数3张涂片。 （3）肺组织收集及处理 支气管肺泡灌洗后迅速打开胸腔，取出左肺，蒸馏水冲洗，无菌处理，于4％多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋、切片，进行HE染色和STAT6免疫组化检测。 1.3 STAT6表达的测量方法 采用图像分析仪对图像进行分析。每张切片在光学显微镜下放大400倍，随机选择至少5个高倍视野后，测定着色细胞平均吸光度(OD)，计算其平均值作为该切片的代表值。 1.4 统计学处理 数据均以均值±标准差（x-±s)表示，统计学处理采用SPSS 11.5软件进行单因素方差分析，多个样本均数的两两比较采用LSD检验,单个样本前后比较采用配对T检验，取P＜0.05为有统计学意义，P＜0.01为有显著差异。 2 结果 2.1症状观察 模型组所有大鼠致敏激发后都出现烦躁不安、易惊、抓耳挠腮、毛发倒伏、大小便增多、呼吸增快、口唇发绀、腹部痉挛、弓背、最后伏俯不动等急性过敏反应，而治疗组及正常组相对较安静。所有大鼠无死亡。 2.2各组大鼠肺泡灌洗液中细胞成分比较 哮喘组及BUD组大鼠BALF中细胞总数，嗜酸性粒细胞（EOS）和中性粒细胞（N）占总白细胞的百分比均高于正常对照组（Plt;0.05）；而BUG组BALF中白细胞总数、EOS%和N%均低于哮喘组组（Plt;0.05），但仍高于正常对照组（Plt;0.05）。见表1。 表1 各组大鼠肺泡灌洗液中细胞成分组成（x-±s） 注：与正常组比较,*Plt;0.05；与模型组比较，△Plt;0.05 2.3各组大鼠BALF中WBC总数及Eos比例比较 大鼠BALF中，模型组WBC总数及Eos百分比较正常组明显增高，差异有显著性意义（P＜0.01）；治疗组WBC总数及Eos百分比较A组明显降低，差异有显著性意义（P＜0.01）；治疗组WBC总数虽稍高于正常组，但无明显差异（P＞0.05），治疗组Eos百分比仍较正常组高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。 表2 各组大鼠BALF中WBC总数及Eos比例比较(x-±s) 注：与正常组相比较★P＜0.05 ●P＜0.01，与模型组相比较▲P＜0.01 表3 各组大鼠血清中IL-4的含量比较(x-±S) 注