年龄因素对大鼠脂肪干细胞成骨诱导分化能力的影响.doc

　　年龄因素对大鼠脂肪干细胞成骨诱导分化能力的影响 【关键词】 组织工程 脂肪干细胞 年龄 成骨分化 种子细胞的选择是骨组织工程的基础和关键之一。骨髓间充质干细胞（Bone marroal stem cells. BMSCs）作为骨组织工程种子细胞已经广泛应用。但骨髓采集量有限，大量抽取会增加机体损伤，并有一定并发症[1]，因此不利于临床大规模的培养与应用。2001年Zuk等[2]通过脂肪抽吸术获得脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells, ADSCs)。ADSCs具有丰富、易于获取[3]、自体移植可以避免排斥反应、并且具有分化为多种中胚层细胞[4]及跨胚层分化[5]等优点，大量研究证实ADSCs在体外培养可以稳定增殖和传代并具有向成骨细胞系分化的能力[6,7]，但是不同年龄段ADSCs的生物学性状不尽相同，若ADSCs成为骨组织工程中理想的种子细胞还应考虑到，年龄因素对细胞增殖及成骨能力的影响，本研究探讨不同年龄阶段ADSCs的成骨分化能力及其机制。为ADSCs是否可以成为理想的种子细胞及为临床应用提供依据。 1 材料与方法 1.1 实验动物及分组 健康SD大鼠30只，雌雄不限，按年龄分为幼年组（1月龄）、成年组（12月龄）和老年组（24月龄），每组10只，体重分别约为150、400和750 g。 1.2 主要试剂 DMEM (Gibco)，胎牛血清(Gibco)，Ⅰ型胶原酶(Sigma)，β—甘油磷酸钠(Sigma)，地塞米松，抗坏血酸，ALP试剂盒(南京建成)，钙含量测定试剂盒(Sigma)。 1.3 不同年龄段ADSCs分离培养 取SD大鼠，脱颈处死，75%乙醇消毒，无菌条件下取腹股沟部及肾下脂肪组织，去除肉眼可见的血管及其它组织，用PBS反复冲洗3次，将脂肪组织剪成大约1 mm3小块，置0.1%Ⅰ型胶原酶中，37 ℃摇床100 r/ min消化60 min，然后1 000 r/min，离心10 min，弃去上层脂滴及上清，沉淀用含10%胎牛血清的DMEM培养基制成单细胞悬液。进行细胞计数，以2 × 105/mL的密度接种于培养瓶中，置37 ℃、5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱中常规培养。原代培养每3天换液。待细胞融合达80%时，吸除原代细胞培养液，加入2 mL 0.125%胰酶-EDTA消化液消化。当观察到细胞突起回缩，形态变圆，细胞间隙增大时，加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM中和胰酶的消化作用，用吸管反复吹打，制成单细胞悬液，移入离心管中；1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入7 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基，吹打制成均匀的细胞悬液，之后1:2传代、扩增培养。 1.4 不同年龄段ADSCs成骨能力检测 1.4.1 ADSCs成骨诱导培养 取第3代细胞经消化后加入含有0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L抗坏血酸的成骨诱导剂的DMEM培养基，每3天换液。以加入不含诱导剂培养基的3代细胞作为对照组。 1.4.2 细胞凋亡率检测 将成骨诱导14 d的细胞用0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA消化液消化，调整细胞密度密度为1 × 106/mL,取1 mL细胞，1 000 rpm离心10 min，弃上清。加入1 mL预冷的PBS震荡重悬，1 000 rpm离心10 min，弃上清。将细胞重悬于200 μL Binding Buffer，加入10 μL Annexin V-FITC和5 UL PI，混匀，室温避光反应15 min，加入300 μL Binding Buffer，上机检测。 1.4.3 碱性磷酸酶(ALP)活性测定 将第3代细胞以1 × 104/孔的密度接种到24孔板。分别在诱导4、8、12、16、20 d，每次各年龄组及对照组各取6孔，按ALP试剂盒要求检测ALP活性。在520 nm波长处测定各孔吸光度并根据公式 计算 ALP含量，结果表示为金氏单位U/100 mL。 1.4.4 钙离子浓度测定 取成骨诱导7、14、21 d细胞各1板，用PBS洗两遍，每孔加入l mL 0.5 mol/L HCI，振荡过夜，次日以1 000 rpm离心10 min，上清液用钙试剂盒测定钙含量。每份上清液取20 μL，按试剂盒说明进行操作，于575 nm波长处测吸光度值，结果表示为μg/孔。 1.5 统计学分析 采用SPSS13.0进行统计处理。所有数据采用x±s表示。组间比较采用单因素方差分析及q检验。方差不齐组经数据转换后再进行方差分析。 2 结 果 2.1 细胞形态学观察 不同年龄阶段大鼠的ADSCs接种后在悬液中细胞呈圆形，不能辨认细胞核。各组在原代培养48 h，可见多数细胞贴壁