IonMate-pair文库构建方法.docxVIP

Ion Mate-pair文库构建手册一、流程图基因组DNA提取↓基因组定量检测↓DNA破碎（Covaris S2）↓末端修复↓文库片段选择（凝胶电泳，SOLiD凝胶回收试剂盒纯化）↓文库片段定量↓MP接头连接（SOLiD MP接头连接试剂盒） ↓纯化Qubit定量↓确定DNA回收量，确定回收到的片段含量（根据DNA含量确定是否可进行下一步）↓DNA片段环化↓纯化环状DNA（除去非环化DNA）↓纯化定量（若起始上样量为1-2ug，则不需要定量）↓环化DNA缺口修复及SOLiD文库试剂盒纯化↓T7核酸外切酶、S1核酸酶 酶切↓磁珠纯化末端修复↓文库片段于链霉素亲和素微珠相连↓连接Ion接头↓缺口修复、预扩增凝胶条带检测（确定循环数）↓片段扩增（使用确定的循环数扩增） ↓SOLiD试剂盒纯化E-Gel胶回收↓Agilent检测，Qubit定量↓文库构建完成二、实验步骤：第一部分：样品打断及定量1.样品质控OD260/280=1.8-2.0使用1-5 ug gDNA起始2.DNA片段化处理使用0.2 ml PCR管，使用LowTE将1ug DNA稀释到200ul，装入0.2的PCR小管中。按照以下条件将DNA打断成3kb大小的片段：Target BP3kbIntensity0.1Duty Cycle20%Cycles per Burst1000Treatment Time（s）600Temperature（℃）20Sample Volume（ul）2003.末端修复使用Mate-Paired Library Enzyme Module按照以下条件配置体系：Compoent3-kb librarySheared DNA67 uL5×Reaction Buffer20.0 uL10 mM dNTP4.0 uLEnd Polishing E14.0 uLEnd polishing E25.0 uLNuclease-free WaterVareisTotal100 uL室温（20-25℃）下放置30min。将以下体系加入到上述反应体系中：Component3-kb library20% SDS8.5 uL10× BlueJuice Gel Loading Buffer10.0 uL65℃变性处理10min，冰上放置5min后，准备琼脂糖凝胶分离和切胶回收4.琼脂糖凝胶电泳及切胶回收准备1%琼脂糖凝胶分离3-kb片段配置琼脂糖胶ComponentVolume1×TAE20.0 mLAgarose0.2 gDu-red稀释液20 uLTotal20 mL使用大孔梳子做成一块分离胶，待胶凝固之后放入电泳槽中，点入Marker和样，120V，80mA电泳20-30min，使用胶回收试剂盒进行切角纯化。5.样品定量使用Qubit2.0对纯化后的DNA片段进行定量。——Stopping Point——第二部分：环化1.计算MP接头加入量：公式：需要加入MP接头的量（uL）Y配置以下体系：ComponentVolumeEnd-repaired DNA60 uL5× Reaction Buffer20.0 uLMPR Adaptor (ds), 25 uMY uLMPL Adaptor (ds), 25 uMY uLT4 DNA Ligase, 5U/uL10.0 uLNuclease-free WaterVariable uLTotal100 uL室温（20-25℃）下放置30min。2.磁珠纯化1）准备体系ComponentVolumeSample reaction100 uLNuclease-free Water150 uLAgencourt AMPure? XP Reagent200 uLTotal450 uLa.震荡混匀15s后，瞬时离心b.室温下（20-25℃）放置5minc.将LoBind 离心管放置到磁力架上至少1min，待溶液澄清后，除去上清液2）保持离心管在磁力架上，使用新配置的70%乙醇洗涤2遍a.向离心管内加入600 uL新配的70%乙醇b.保持离心管在磁力架上1min，小心除去上清3）取下离心管，瞬时离心后，将离心管放回磁力架，待溶液澄清后，使用20uL枪头除去剩余的乙醇4）打开离心管，室温下干燥3min，除去多余的乙醇5）洗脱a.将离心管从磁力架上取下，向管内加入50 uL Elution Buffer（E1）b.漩涡混匀15s，瞬时离心，室温下放置3minc.将离心管放回到磁力架上至少1min，至溶液变得澄清d.将上清液放置到一支新的1.5mL LoBind离心管3.Qubit定量使用Qubit 2.0对回收的DNA片段进行定量回收片段/始上样量处理5%进行环化处理5%可进行环化处理，但后续的