PCR-反向点杂交法在结核杆菌耐药突变基因检测中的应用.pdfVIP

广东医学 2013年2月 第 34卷第3期 GuangdongMedicalJournal Feb．2013，Vo1．34，No．3 · 395 · PCR一反 向点杂交法在结核杆菌耐药突变 基 因检测 中的应用 何进才 ，周丹 ，劳诗欣 ，李惠贞 ，黄涛 ，单万水 广东省深圳市中医院检验科 (518033)；广东省深圳市第三人民医院检验科 (518112) 【摘要】 目的 了解深圳结核病患者结核杆菌耐药基因突变和耐药情况，评价PCR一反向点杂交法检测结 核杆菌耐药基因突变的方法学性能。方法 采用PCR一反向点杂交法检测264例 (初治患者 141例 ，复治患者 123例)临床分离结核杆菌菌株或经抗酸染色镜检为阳性的痰标本 中结核杆菌 13个耐药基 因突变位点。以DNA 测序法为金标准，评价PCR一反向点杂交法检测结核杆菌耐药基 因突变的方法学性能。结果 264例结核病患者 对4种常用抗结核药物中1种或以上耐药者90例 ，耐药率34．09％，其中耐多药率 19．32％。141例初治患者耐药 率为 17．73％，耐多药率为4．96％。123例复治患者耐药率为52．85％，耐多药率35．77％。对异烟肼、利福平、链 霉素和乙胺丁醇的耐药率分别为22．73％、20．45％、15．91％和6．82％，相应最常见突变位点分别为315M、s531L、 43M和 306M2。突变位点检出率超过 5％的为 315M(28．74％)、43M(20．69％)、$531L(15．52％)、15M(8．62％)、 306M2(6．90％)和H526Y(5．17％)。PCR一反向点杂交法检测结核杆菌耐药基因突变的敏感度为94．74％、特异 度为 100％、准确度为98．11％，Kappa值为0．9584(95％ ：0．8379一1．0789)。结论 深圳结核病患者对抗结核 药物耐药率和耐多药率均较高，复治患者耐药率和耐多药率分别比初治患者高2倍和 6倍 ，对异烟肼、利福平、链 霉素和乙胺丁醇的耐药性依次降低 ，相应最常见耐药基 因突变位点分别为315M、$531L、43M和306M2。PCR一反 向点杂交法检测结核杆菌耐药基因突变的敏感度、特异度和准确度均能满足，临床要求，适合临床实验室使用。 【关键词】 结核杆菌；结核病 ；耐药性；基因突变；聚合酶链反应；反向点杂交 结核病 (tuberculosis)是严重危害人类健康的慢性 色镜检按 “全国结核病细菌学检验标准化规程”进行 ， 传染病，结核杆菌耐药性检测和研究对结核病防治具 PCR一反向点杂交法按试剂盒使用说明书操作 ，DNA 有重要意义。以往文献报道结核杆菌耐药性研究多基 测序委托上海英骏公司完成。PCR一反向点杂交法检 于长达 1个月的结核杆菌培养鉴定及药敏试验 ，或针 测结核杆菌耐药突变基因，根据 rpoB、katG、inhA、rpsl、 对 1种或2种抗结核药物的耐药基因。本研究采用近 embB基因序列和 16SrRNA编码基因设计、合成5对引 年发展起来的高通量的PCR一反向点杂交法检测结核 物 ，可分别扩增引起利福平耐药性 的rpoB基 因、引起 杆菌 13个耐药突变基因，旨在从分子水平了解深圳地 异烟肼耐药性 的katG基因和 inhA基因、引起链霉素 区结核病患者结核杆菌耐药基因突变和耐药情况，并按 耐药性的rpsL基因和引起乙胺丁醇耐药性的embB基 照 “盲法、随机、平行”原则 ，对所有标本同时用PCR一反 因，5种基因的扩增产物分别为460、210、190、305、245 向点杂交法和 DNA测序法检测，以评价 PCR一反向点 bp。探针 的设计和合成 ：rpoB基因选择 3个常见的突 杂交法检测结核杆菌耐药突变基因的方法学性能。 变位点：531位 TCG—TFG、TGG，526位 CAC—TAC、 1 资料与方法 GAC，516位 GAC~GTC、GGC；katG基因选择突变概率 1．1 标本来源 264例标本来 自2010年 1月至2011 高的3l5位点AGC-~ACC、AAC；inhA基因选择突变概 年9月深圳市第三人民医院结核杆菌临床分离菌株及 率较高的一15位点；rpsl基