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HPLC的各部分构成及应用高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代发展起来的一种新型分析、分离技术。它是在经典液相色谱法的基础上，引入气相色谱法的理论和技术，以高压输送流动相，采用高效固定相及高灵敏度检测器发展而成的现代液相色谱分析方法。现代HPLC采用了小口径柱（约1～3mm）和极细小的高效色谱填料（粒径 5μm），用高压输液泵使溶剂以高流速（1～10cm/s）通过色谱柱，分离速度比经典柱色谱法快100～1000倍，分离效率已接近毛细管柱气相色谱法。因此， HPLC具有高压、高速、高效、高灵敏度四大特点。HPLC与GC比较，虽然需要解决延长使用寿命的问题，但专家们普遍认为在众多分析领域中HPLC比GC 更加实用。HPLC能够分析受到热稳定性和挥发性限制的化合物，而用GC分析这些化合物时则必须借助其衍生物。由于HPLC具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用、流出组分易收集等优点，所以被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等领域[2]。本次图文讲座在于解析HPLC的各部分构成及应用，供大家学习参考。第一部分：HPLC的各部分构成1.GIF(8.04 K)2011-4-6 10:55:11图一一.流动相选用的溶剂均为HPLC 等级(水 : 18 兆欧)，溶解性要好，折射率要低。 溶剂需要进行过滤和脱气以防损坏泵及柱子。过滤用专门配备的水性过滤膜和有机过滤膜分别对水相和有机相进行过滤。脱气主要是去除空气、氧气、气泡，可采用真空脱气、氦脱气或者超声波处理。在使用过程中会可能含有缓冲液，一般加入缓冲液目的在于调节PH/抑制离子/调节离子浓度以改善峰型、选择性、保留时间等。二．溶剂传输系统 (泵)--将溶剂（流动相）从溶剂瓶传送到进样器。 传输溶剂的泵需要考虑的要点：1. 流速和压力的稳定性；2. 操作方便, 可用于多种不同的溶剂；3. 防止脉冲的系统；4. 可用于等梯度模式和梯度模式；5. 久耐用。流路图2.GIF(19.15 K)2011-4-6 10:55:11图二：泵操作模式：等梯度模式-分析过程中，溶剂组分保持不变；梯度模式-分析过程中，按时间改变溶剂组分。单泵 : 低压梯度模式并联泵 : 高压梯度模式等梯度模式3.GIF(7.76 K)2011-4-6 10:55:11图三：单泵 : 氦脱气和真空脱气 4.GIF(7.93 K)2011-4-6 10:55:11图四：并联泵5.GIF(10.05 K)2011-4-6 10:55:11图五：操作泵的注意点1. 必须对溶剂进行脱气 ；2. 勿空转；3. 使用缓冲溶液之后一定要用水清洗；4. 检查溶剂间的可混合性；5. 启动泵之前要灌泵；6. 控制脉冲；7. 检查泵压。三、进样系统进样阀：流动相中加载样品，使流动相把样品带入色谱柱。6.GIF(12.44 K)2011-4-6 10:55:11图六：进样阀包括手动进样阀和自动进样器使用进样阀的注意点1. 使用进样针前要清洗干净，并去除气泡 ；2. 清洗进样针 : 选择样品易于溶解的溶剂3. 附加清洗方法 : 使用过的溶剂 → 丙酮 →二氯甲烷；4. 使用自动进样器针管清洗溶液时要格外注意；5. 连接管线越短越好 (进样阀和色谱柱, 色谱柱和检测器)；6. 管线的错误连接会导致死体积的发生。进样阀：1. 定量环进样阀 → 进样量由定量环体积决定；2. 需要定期清洗定量环7.GIF(11.94 K)2011-4-6 10:55:11进样方式1. 全充满：进样量是固定时-- 进样体积 : 定量环体积的三倍以上；正确性 : 0.1%。2. 部分充满：进样量是可改变时 --进样体积 : 小于定量环体积的一半；正确性: 1% 。自动进样器--自由进样，改善了实验室的生产力；极好的重现性；自动化温度控制, 预处理。自动进样器类型：一般包括圆盘式和栅格式。8.GIF(13.08 K)2011-4-6 10:55:11图八四、色谱柱9.GIF(18.47 K)2011-4-6 10:55:11图九色谱柱把混合物分离成各个单个成分 色谱柱的选择根据以下四个方面进行选择：1.填料；2. 粒径；3.硅胶形状；4.孔径。填料性质10.GIF(9.05 K)2011-4-6 10:55:11图十粒径大小：填料的粒径越小，分离度 → 增加，背压 → 增加。11.GIF(9.11 K)2011-4-6 10:55:11图十一硅胶形状12.GIF(38.43 K)2011-4-6 10:55:11图十二不规则形球形孔径大小: nm or ?选择孔径大小的方法13.GIF(5.88 K)2011-4-6 10:55:11图十三一般填料特性孔径大小 分配 :孔径小 = 柱效高 = 减小谱带展宽现象。球形或不规则形 : 不规则形= 表