丹毒丝菌pcr快速检测方法建立.docVIP

猪丹毒丝菌PCR检测方法的建立 谭侃侃 李润成 林荣高 蒋伟 屈泰龙 田世成 （湖南农业大学 动物医学院,湖南 长沙 410128） 摘 要：根据GenBank中猪丹毒丝菌的16S rRNA基因序列的差异设计特异性引物，对6株临床分离的丹毒丝菌菌进行PCR扩增。结果显示，此引物对6株丹毒丝菌均扩增出与预期大小471 bp相一致的片段，而对多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌等10种病原体的扩增结果均为阴性；PCR敏感性试验结果表明，本方法可以检测到186cfu/μL的丹毒丝菌，并可以利用临床病料直接进行检测，节省了检测时间和劳动力，能够适用于日常实验室的检测。 关键字：丹毒丝菌；16S rDNA ；PCR 丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)是专性厌氧的革兰氏阳性小杆菌[1]。该属主要包括两个种，红斑丹毒丝菌（E.rhusiopathiae）和扁桃体丹毒丝菌（E.tonsillarum），其中仅红斑丹毒丝菌(俗称猪丹毒丝菌)是具有致病力的毒力种，是猪丹毒和人类类丹毒症的致病菌，猪感染后致死率极高，使养猪业遭受巨大经济损失，同时也对人类的健康构成一定的威胁[2]。丹毒丝菌的血清型很多，现在已经报道有16种血清型，不同的血清型在毒性上面的差别很大,一般从病猪分离的菌株绝大多数是血清型1a、1b和2型[3]，能够引起猪的急性或亚急性败血症和慢性的关节炎及心内膜炎，对其它许多家禽家畜也存在一定的危害[4]。由于丹毒丝菌的营养要求高，细菌菌落较小，分离鉴定繁琐费时，给临床上丹毒丝菌的快速诊断带来了许多困难。为此，本实验室根据Genebank上的16SrRNA序列设计通用引物，建立快速检测丹毒丝菌的PCR鉴定方法。 1 材料与方法 1.1试验使用菌株 丹毒丝菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、气单胞菌、李氏杆菌、芽孢杆菌和链球菌，由湖南农业大学动物医学院病源分子生物学和免疫学实验室分离、鉴定和保存；粪肠球菌（ACTT 29212）、大肠杆菌（ACTT 35218）、金黄色葡萄球菌（ACTT 29213），购于杭州天和微生物公司； 6株丹毒丝菌临床分离株，分离于湖南各地送检至湖南农业大学传染病实验室的猪病料。 1.2 主要仪器试剂 Taq DNA Polymerasea购自天根生物工程公司 dNTP(2.5mM)、DL2000 DNA Marker均购自大连宝生物工程公司 TSB培养基购于北京鼎国昌盛生物技术公司。 1.3 引物的设计 从NCBI库查出已发表的丹毒丝菌所有16SrRNA基因序列中，找出16SrRNA基因的保守区；运用DNAstar中的MegAlign子程序分别与其它常见细菌（大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌、链球菌）的基因序列进行多重比较，找出丹毒丝菌的特异序列。以AB034200序列，利用软件oligo 6在丹毒丝菌16SrRNA基因的特异保守区内设计PCR引物：F:5’- TGACATACCGCGCAAAAGCA-3’（位置982-1001） R:5’- GGCTCCCTCCTAGTAAACTA -3’ (位置1434-1453),预计扩增产物471bp。 1.4 PCR模板的准备 挑取一个菌落置于装有200μL超纯水的离心管中，搅匀。将离心管置于100°C水浴加热5min，冰浴冷却，12 000r/min离心2min，吸取上清至另一离心管，置-20°C冻存备用。同时也用纯培养菌落和液体培养菌液直接作为PCR模板。 1.5 PCR反应条件选择 10×PCR buffer2μL，dNTP(2.5 mmol/ L)1μL，上、下游引物各μL（引物量10μM），Taq酶（2.5U/μL）0.5μL，μL，加至2μL总体系。95℃预变性min ，94℃变性30s，℃30s，然后分别加减1℃共设置10个梯度（50℃～60℃），72℃延伸30s ，30个循环，72℃终延伸7min10g/L琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色后在凝胶成像系统拍照分析。 1.6 PCR特异性 将本实验室保存菌种：多杀性巴氏杆菌、气单胞菌、李氏杆菌、肠沙门氏菌、芽孢杆菌、链球菌、粪肠球菌（ACTT 29212）、大肠杆菌（ACTT 35218）、金黄色葡萄球菌（ACTT 29213）与丹毒丝菌，用1.3设计的引物按照上述PCR反应条件对菌株进行扩增，另外将丹毒丝菌的PCR产物送往上海生工测序，通过核苷酸序列分析确定PCR扩增的片段为目的片段。 1.7 PCR敏感性试验 挑取丹毒丝菌固培养液菌落1个或数个溶于50μl生理盐水中，吸取10μl加入90μL生理盐水，然后依次做10倍稀释，做成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5，10-6,10-7,10-8八个梯度，将每个梯度吸取1μl作为模板进行PCR扩增，另吸取5