绿色发光蛋白的研究及其应用.docVIP

一 前言 随着生命科学和医学研究的不断深入，研究者们迫切需要一种能够在活体中易于检测的报告基因。而绿色荧光蛋白以一种全新的非酶性报告基因引起人们的广泛关注。该蛋白能够自身催化形成发光结构并在蓝光或紫外光的激发下发出绿色荧光。作为报告基因，绿色荧光蛋白能够在活细胞中表达发光蛋白。作为荧光标记分子，绿色荧光蛋白既具有敏感的标记检测率，又没有放射性危害。绿色荧光蛋白的出现将彻底改变过去标记研究方法，在分子生物学中有广阔的应用前景。 二 本论 2.1 绿色发光蛋白的发现 在北美西岸的“星期五港湾”(Friday Harbor) ,一种名为Aequorea victoria的水母在受到刺激时,周边组织会发出绿色的荧光，它不仅仅照亮了自己身边的环境,也照亮了人们在分子水平上研究和监测细胞内与细胞间动态过程的道路。这种发出绿色荧光的物质就是绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)[1]。 在1960年,下村修加入了F. Johnson在普林斯顿的实验室,对Aequorea victoria发出生物冷光现象的发光机理进行研究。最初, Aequorea victoria中发出生物冷光的活性成分被认为是一种名为水母素的蛋白质,它是一种荧光酶,遇到钙离子就会发出蓝光。然而, Aequorea victoria的生物冷光却是明显的绿色,这个现象使人们感到非常好奇。1962年,下村修和F. Johnson发现了一种新的蛋白质,其在阳光下呈浅绿色、钨丝灯下呈黄色、紫外光下呈强烈绿色。1974年,他们纯化了该蛋白———绿色荧光蛋白。尽管下村修开始的主要兴趣是研究水母素在生物冷光方面的性质,包括作为活体细胞的钙指示剂,但后来他还是将注意力转向了GFP的发色团并试图阐明它的化学结构。总的说来,下村修对GFP的发现、提纯以及对其物理化学性质的描述做出了重要贡献。没有下村修的先驱性工作,GFP革命很有可能会延迟几十年到来,甚至永远成为埋藏在太平洋底的秘密。 由于对绿色荧光蛋白的发现、机理研究以及利用做出的特殊贡献,瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员于当地时间2008年10月8日宣布,将2008年度诺贝尔化学奖授予美国科学家下村修、马丁·沙尔菲和美籍华裔化学家钱永健。 2.2 GFP的优点 2.2.１ 不受假阳性干扰,灵敏度高　 GFP荧光反应不需要外加底物和辅助因子, 只需紫外光或蓝光激发, 即可发出绿色荧光, 用荧光显微镜甚至肉眼就可以观察到,而且其他生物本身不含有GFP,因此不会出现假阳性结果。GFP作为分子探针可以代替荧光染料,避免由于染料扩散造成的定位不准,使结果真实可靠。而且其灵敏度高,比免疫组织化学方法具有更高的灵敏度和分辨率。 2.2.２ 荧光稳定　 GFP对光漂白有较强的耐受性, 能耐受长时间的光照；GFP在很大的pH范围内(7～12.2)也能正常发光。对高温(70℃)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数都有较强抗性[4]。 2.2.３ 无毒害　 GFP与目的基因融合后,对目的基因的结构功能没有影响,大量表达对细胞也无毒性作用,细胞仍可连续传代培养。 2.2.４ 通用性　 GFP的表达几乎不受种属范围的限制, 在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达，其次是GFP没有细胞种类和位置上的限制, 在各个部位都可以表达发出荧光。 2.2.５ 易于构建载体　 GFP分子量较小,仅为27～30kD,编码GFP的基因序列也很短,为2.6kb,所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒, 而不至于使质粒过大影响转化频率[11]。 2.2.６ 可进行活细胞定时定位观察　 通过GFP可实时观察到外界信号刺激下, 目的蛋白的变化过程, 借助于近来广泛使用的激光扫描共聚焦显微镜, 结合强大的计算机软件, 可进行三维显示。 2.2.７ 易于得到突变体　 GFP中氨基酸的替换可产生不同光谱特性的突变体, 且增强了荧光强度, 适合在不同物种中专性表达。通过生物化学的方法将基因做小小的改变, 就可以改变GFP中的氨基酸, 得到变异GFP。 2.2.8 可制成永久装片 GFP的荧光可以耐受漂白，也可耐受福尔马林的固定，因而可以制成标本长期保存．　　 2.３ 影响GFP表达强度的因素 2.３.1 表达温度对GFP荧光强度的影响 尽管GFP荧光是稳定的,但GFP生色团的形成对温度敏感。在细胞生物学应用过程中,各种GFP突变型在高温下的正确折叠非常重要。在酵母中,当细胞在15℃生长时,GFP荧光值为最大，当培养温度升至37℃时荧光强度下降约25%。 2.３.2 酸碱对GFP荧光强度的影响　 GFP在pH 5.5～12的范围内都可以保持较高的荧光性能，GFP荧光可在pH 7～12的试剂中保持稳定,pH 5.5～7.0时,荧光强度减弱。但极端的pH,如pH 4.0或