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如何构建一个高效表达真核生物基因的大肠杆菌的表达体系 华中师范大学 生命科学学院生物科学 2011211870 李书婷 概要：构建一个高效的表达体系,包括了对宿主菌的选择及相应载体的构建。基因工程技术的核心是基因表达技术。影响基因在大肠杆菌中表达的因素是多方面的，以下我就从载体选择、启动子、终止子、核糖体结合位点、密码子、质粒拷贝数、表达产物的稳定性、受体细胞代谢等方面说明构建大肠杆菌高效表达的方法。大肠杆菌作为宿主菌的特点1，原核生物单细胞异样，生长快，代谢易于控制。能快速获得大量基因代谢表达代谢产物。2，基因结构简单，便于基因操作和基因分析。3，原核生物内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的载体。4，生理代谢途径及基因表达机制比较清楚。 关键词：表达载体 启动子 终止子 核糖体结合位点 翻译密码子 质粒拷贝数 一、表达载体 表达载体应具有以下条件： 1、能够独立复制。 2、应具有灵活得多克隆位点和方便的筛选标记，便于外源基因的克隆、鉴定和筛选。而且多克隆位点应位于启动子序列之后，以使外源基因表达。 3、应具有很强的启动子，能被大肠杆菌的RNA聚合酶识别。 4、应具有使启动子受抑制的阻遏子，只有在受到诱导时才能进行转录。 5、应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关基因。 6、所产生的mRNA必须有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列。 二、启动子 启动子是表达载体最重要的组成成分，这是因为启动子控制了基因表达的第一个阶段，决定了mRNA合成的速度。 启动子是在转录水平上影响基因表达。转录的最大速率取决于启动子中碱基的组成，往往会因为一个碱基的不同，启动子效率可能提高上千倍。也就是说启动子会有强弱之分。要获得高校表达必须选择强启动子。由于真核基因启动子不能被大肠杆菌RNA聚合酶识别，因此必须将真核基因编码区连接在大肠杆菌RNA聚合酶能够识别的强启动子控制之下。通常用的强启动子有lac、trp、tac、bla、λPL等，将外源基因插入这类启动子的下游，可以增加基因的表达产量。 终止子 虽然转录终止子在表达质粒的构建过程中常被忽略，但有效的转录终止子是表达载体必不可少的元件，因为它们具有极其重要的作用。贯穿启动子的转录将抑制启动子的功能，造成所谓的启动子封堵。这种效应可以通过在编码序列下游的适当位置放置一转录终止子，阻止转录贯穿别的启动子来避免。同样地，在启动目的基因的启动子上游放置一转录终止子，将最大限度地减小背景转录。 四、核糖体结合位点 1、Shine-Dalgarno（SD）序列 一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降低。 2、翻译起始密码子 已知序列的绝大部分（91%）E.coli基因的翻译起始区均含有起始密码子AUG，GUG的利用率为8%，而UUG的利用率则为1%。大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50%，而UUG只及AUG的25%。 3、SD与起始密码子间的距离及碱基组成 SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低。 紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍。 此外，从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5’ 端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位。 密码子 不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性。 对E.coli中密码子的使用频率进行系统分析得到以下结论： （1）对于绝大多数的简并密码子中的一个或两个具有偏好； （2）某些密码子对所有不同的基因都是最常用的，无论蛋白质的含量多少，例如CCG是脯氨酸最常用的密码子； （3）高度表达的基因比低表达的基因表现更大程度的密码子偏好； （4）同义密码子的使用频率与相应的tRNA含量有高度相关性。 这些结果暗示,富含E.coli不常用密码子的外源基因有可能在E.coli中得不到有效表达。通过用常用密码子替换稀有密码子或与“稀有”