流式WBRT-PCR等实验所需细胞数问题.docVIP

1、流式所需细胞数 问：因为我做流式需要做很多次，就想到用六孔板做，六孔板的一个孔内的细胞数够不够做一次流式用？有没有人用过这个方法？请大家给个建议。 丁香网友zhaoyihenglk认为：足够了！流式检测所需的细胞的数量级105，而六孔板长满能达106。 问：请问用96孔板作的转染可以做流式细胞仪分析么？做流式细胞仪分析要用多少微升的悬液？谢谢！ 丁香网友zhaoyihenglk认为：一般我们使用500微升的悬液上机检测！！！ 问：请问流式检测的最小的细胞数量是多少，如果小于一个细胞的话是否就不能采用流式检测了。流式要求的细胞的最小体积是多少，我最近收集了少量细胞团，30-50 微米，因为将细胞团中的各个细胞分离开较难，是否可以用于流式的检测？ 丁香网友XTYang认为：如果不能将细胞分散成单个细胞悬液的话是无法用流式细胞法分析的。 丁香网友swarm认为：检测时最少要有2000个细胞，但最初准备样品时，如果只做外标，样品比最少细胞数大一个数量级即可；但要是需要作内标的话，固定液和穿膜液粘度大，细胞损失也多，而且，穿膜液一般对细胞还有损伤，故样品细胞数要比最少细胞数大2个数量级！做流式，细胞必须是单细胞悬液，成团细胞可用胰酶处理，或是在细胞样品中加2mM的EDTA，防螯合。 问：请问流式检测的最小细胞数是多少？如分离出两种细胞，一种细胞数很少，但体积很大，另一种细胞是其数量的10-20倍，是否可以用流式同时检测呢？ 丁香网友XTYang认为：记得有人研究用针头取样后进行流式分析的文章，所以细胞数应该是可以很少的.在大量细胞中检测低频率事件（即你例子中的第一种细胞）正是流式的优点.关键是你的第一种细胞在大小，密度或荧光标记上和其他大量细胞有区别，并且细胞团能用酶解或机械方法处理成单细胞悬液. 问：流式能检测含多种细胞的标本吗?细胞碎片影响流式检测效果吗?怎样在检测前去除细胞碎片? 丁香网友swarm认为：能检测含多种细胞的标本因为流式本身能根据细胞的大小及细胞内容物颗粒大小（即所谓的流式仪所用的前向光和侧向光）来区别不同的细胞群而通常做研究时是荧光标记你感兴趣的亚群进行分析含有碎片会有一点点影响，但用空白样品（未作任何荧光标记的样本）选定你想研究的细胞群体时，即可排除细胞碎片，因为碎片所反映的前向光和侧向光和完整的细胞基本不相同 。 2、Western和RT-PCR所需细胞数 问：我是实验新手，拟在细胞上行WB和RT-PCR，由于实验基础太差，不知道细胞水平行WB和RT-PCR所需多少细胞，一般用多大的板子培养才能提足所需蛋白和RNA，请园子里的朋友们不吝指教，多谢！ 丁香网友zhangyuelin1999认为：我做过WB的，细胞数目要达到10*6个，这样提出的蛋白就可以了！因此一般的六孔板就可以了！24孔板，96孔的感觉有点小了，空间太小细胞长就不好了！先前要计个数的，然后进行蛋白定量的！悬浮的就直接离心得沉淀，裂解得蛋白的就可以了，贴壁的要用到细胞刮子。RT-PCR就不太清楚了，祝实验顺利！ 丁香网友everever认为：看你要养的细胞是哪种了，有的细胞的体积就很小，而有的细胞则铺得很开。做RT－PCR用两步法即先抽RNA经反转录再做PCR一般要用到1ug的总RNA。（1ug经反转录成20ul体系后一般可做至少50次20ul体系的PCR）常规做WB一个孔道上样要10＊5个细胞。但也和你的目的蛋白及提取的方式有关。如果是膜蛋白或是某细胞器内分布的蛋白细胞数得增多。你最好和你们实验室做过相关实验的人讨论一下。 问：我初次作RT-PCR 和Western，请教要使用多少转染后的细胞呢？转染效率是多少？瞬时转染是否可以传代呢？对检测有多大的影响？ 丁香网友lym569认为：一般转染效率达到50%的话，一个24孔班板的细胞足够做RT-PCR 和Western了，你可以做一个6孔板转染或2个24孔细胞转染.瞬时转染可以传代，但传代后所转染的细胞会越来越少.你传代的目的是什么?如果想稳定表达的话，你应该作稳定转染。 问：你的“一般转染效率达到50%的话，一个24孔班板的细胞足够做RT-PCR 和Western了”是不是可以这样理解：转染效率50％，24孔板上每个孔均长满细胞。一半细胞用作RT-PCR ，另一半用作Western。再弱弱的问：是刚好够吗？您的建议：你可以做一个6孔板转染或2个24孔细胞转染。24孔板2个是为了保险。那6孔板是？？ 丁香网友lym569认为：转染效率50％，24孔板上每个孔均长满细胞。一半细胞用作RT-PCR ，另一半用作Western 足够用了. 做2孔是其中一孔做RT-PCR ，另一孔做Western，这样操作起来比较方便，一个24孔板上的细胞够你做几次Western了.如果用6孔板，