蛋白纯化和GST沉降技术.docVIP

蛋白纯化和GST沉降技术 【原理】 细菌表达的谷胱甘肽s－转移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将GST融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体前，或发现抗体干扰蛋白质－蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用 。 【应用】 1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用 2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用 【方法】 一、GST融合蛋白的纯化 1、菌种的活化：按1%的量在螺旋管中活化所需菌种，一般50ul的冻存菌接入5ml的LB中，37℃ 220rpm培养 活化的菌种转接1%接种于5mlLB中，37℃ 220rpm培养至OD≈0.4~0.6 之间，即到达对数生长时期（大约3~4小时） 取1ml菌液测定OD值，至OD≈0.4~0.6 之间，则取诱导前1ml，其余的按1/1000加入诱导剂IPTG ，低温小量诱导30℃ 200rpm，诱导过夜（小于16hr） 次日取诱导后1ml，诱导前和诱导后各1ml，12000rpm ，离心2mins，弃上清，加适量的1*PBS,重悬菌液，再加1* loading buffer，混匀，沸水煮10mins, 12000rpm ，离心2mins，SDS电泳考马氏亮兰染色 如果考染结果显示GST融合蛋白（GST-X）诱导出来，则做大量诱导 菌种活化后按1%转接种于100ml LB中，30℃ 200rpm 扩大培养至OD≈0.4~0.6 之间，即到达对数生长时期（大约3 小时） 取1ml菌液测定OD值，至OD≈0.4~0.6 之间，按1/10000 加入诱导剂IPTG ，低温诱导20℃ 180rpm，制冷系数0.5 ，诱导过夜 次日50ml离心管收菌, 4℃ 5000rpm 5mins 离心，每瓶100ml重复离心收于同一离心管中，大型离心机提前预冷 每100ml 菌液沉淀加入10ml A 液重悬 超声破碎。大探头，冰浴，频率5~10。超声2~3s停2~3s, 15~20次一个循环，重新混匀，冰探头，至菌液清亮为止 超声后的细菌裂解液加入到50ml 干净离心管中，4℃ 11000rpm 10mins离心 平衡Agrose-beads. 每个干净EP管中加50ul Agrose-beads。再加1ml A 液，4℃ 旋转 2~3mins后4℃ 3000rpm/600 g 5mins 离心，吸弃上清，重复3次 吸取菌液离心上清到50ml 干净离心管，将平衡好的Agrose -beads加入4℃ 旋转 4小时左右 4℃ 3000rpm/600 g 10mins 离心。移液管吸弃上清，留有1ml左右时用移液器枪头混匀X-GST-beads，转移至1.5 ml进口 EP 管中，用A 液反复洗50ml 离心管多次至将全部珠子转移至EP 管中。3000rpm/600 g , 5mins,离心,弃上清 A 液洗涤X-GST-beads，每次1ml 4℃ 旋转 10mins后4℃ 3000rpm/600 g , 5mins, 离心，吸弃上清，重复3次 最后向X-GST-bead 中加入100 ul A 液，4℃ 保存 考染定量 ：取2ul GST-beads 加入 10 ul 1* loading buffer 混匀，沸水煮样10mins 。12000rpm 5mins 离心后取上清上样 （SDS）。下胶后，考马氏亮兰染色（新考染液2~3 mins，旧的考染液10~30mins ）,脱色2 h左右 二、GST Pull down 1、转染细胞24 小时后，IP buffer裂解，超声破碎。大探头，冰浴，频率5~10。超声2~3s停2~3s, 15~20次一个循环，重新混匀，冰探头，至菌液清亮为止，12000rpm, 离心2mins, 取上清作样品，取部分作In put,剩下的作GST Pull down 2、根据定量结果取X-GST-beads 加入到IP buffer 平衡，4℃ 旋转 2~3mins后4℃ 3000rpm/600 g 5mins 离心，吸弃上清，重复3次。然后将平衡后的珠子于600ul cell lysis结合孵育4h~过夜 3、4℃ ，3000rpm/600 g ， 5mins 离心后吸回裂解上清，IP buffer洗珠子，4℃ 旋转 10mins后，4℃ 3000rpm/600 g 5mins 离心，2~3次。最后用微量上样器将全部IP buffer吸弃。 向X-GST-beads其中加入30 ul 1* l