循环肿瘤DNActDNA.PPT

Safe-SeqS技术 In the first step, each fragment to be analyzed is assigned a unique identification (UID) DNA sequence (green or blue bars). In the second step, the uniquely tagged fragments are amplified, producing UID families, each member of which has the same UID. A supermutant is defined as a UID family in which ≥95% of family members have the same mutation. 姜晓星 2015-10-9 伊丽莎白·福尔摩斯（Elizabeth Holmes），曾在斯坦福大学学习微流体和纳米研究技术，在19岁离开大学不久后，创办了Theranos公司 公司的名字由“therapy”（疗法）和“diagnosis”（诊断）两个词组成 这家公司首要任务是做早期、症状显现前的疾病监测，并以此来挽救生命 她的技术可以达到血液测试只需要刺手指贮存一小瓶血液即可，这瓶血液叫做“nanotainer” 这一小瓶样本可以做30多个实验测试，患者可以在4个小时内收到测试结果 Introduction A new generation of biomarkers has become available with the discovery of the genetic alterations responsible for the initiation and progression of human cancers Virtually all cancers of every type harbor somatic genetic alterations including single-base substitutions, insertions, deletions, and translocations 循环肿瘤细胞（circulating tumor cell , CTC） 循环肿瘤DNA（ circulating tumor DNA，ctDNA） 肿瘤诊断方法 血清标志物：蛋白类（癌胚抗原，糖类抗原，甲胎蛋白等），核酸类（microRNA, LncRNA） 影像学诊断(超声，CT，MRI，PET，PET-CT) 循环肿瘤DNA(ctDNA) 人体血液循环系统中不断流动的携带一定特征（包括突变，缺少，插入，重排，拷贝数异常，甲基化等）来自肿瘤基因组的DNA片段 来源：1、来自于坏死的肿瘤细胞；2、来自于凋亡的肿瘤细胞；3、循环肿瘤细胞；4、来自于肿瘤细胞分泌的外排体； 含量低，约占整个循环DNA的1%，甚至只有0.01% ctDNA检测方法 数字PCR BEAMing技术 Safe-SeqS技术 标记扩增深度测序（TAM-Seq） 癌症个体化深度测序 (CAPP-Seq) 数字PCR 将一个标准PCR反应分配到大量微小的反应器中，在每个反应器中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子( DNA模板) ，实现“单分子模板PCR扩增”，扩增结束后，通过阳性反应器的数目“数出”目标序列的拷贝数 阴性微滴比例推算 起始靶分子的绝对量 泊松分布 一个 待分析的PCR反应体系 成千上万个 独立的PCR反应体系 : 靶标分子 : 有限稀释 ●: 阳性微滴（1） ○: 阴性微滴（0） 泊松分布 PCR扩增 优点 可绝对定量，灵敏度可达单个核酸分子，检测限低至0.001% 缺点 只能检测已知的突变位点，通量低 结合数字PCR与流式技术，利用特异性PCR引物扩增目标突变区后，与磁珠（磁珠上固定有特异的PCR 引物）混合进行油包水单分子扩增反应。反乳化作用后，利用不同颜色的荧光探针结合磁珠上的PCR产物，发出红色或绿色荧光。使用流式细胞仪分析磁珠颜色来确定突变情况 BEAMing技术 Results Patients with metastatic cancers Patients with localized disease Comparison of ctDNA with CTCs Comparison of rearrangements with single-base substitutions in ctDNA The sensitivity and specificity of liquid biopsy Monitoring patients for resistance-conf