第4章 酶的分离与纯化.ppt

酶纯化的特点： 1）在细胞中的含量少 2）可以测定酶活力跟踪酶 判断分离纯化方法： 1）总活力的回收率 2）比活力提高的倍数 比活力：在特定条件下，1mg酶蛋白所具有的酶活力单 位数 酶分离纯化的一般流程 1）预处理（pretreatment） 包括发酵液处理和细胞破碎等 2）初步纯化（rough fractionation） 除去与目的产物性质差异很大的杂质 盐析，等电点沉淀和有机溶剂沉淀等 3）高度纯化（fine fractionation） 除去与产物性质相似的杂质 层析，电泳法等 4）浓缩与干燥（concentration and desiccation） 使酶与溶剂分离的过程 旋转蒸发，透析，超滤和冷冻干燥等。 （二）酸、碱溶液提取 胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶，0.12mol/L 硫酸提取 L-天门冬酰胺酶,pH 11-12.5 pH远离等电点 防止蛋白变性 （三）有机溶剂提取 与脂结合牢固或分子中非极性侧链较多的酶，不溶于水，酸或碱中。 乙醇、丙酮和丁醇 （二） 有机溶剂沉淀（降低介电常数） 利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。 1. 沉淀机理 降低溶液的介电常数 部分地引起蛋白质脱水 2. 常用有机溶剂 丙酮?乙醇?甲醇，用量一般为酶液体积的2倍左右，终浓度为70%。 3.优缺点： 优点：1）分辨率比盐析法高 2） 沉淀不需脱盐 3）溶剂易蒸发，沉淀易离心 缺点：1）容易引起蛋白质变性失活 2)有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。 （三） 等电点沉淀(isoelectric precipitation) 1.原理 蛋白质在等电点时溶解度最低 不同的蛋白质具有不同的等电点 2. 使用方法 单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白），多与其它方法联合使用（如盐析法、有机溶剂法），因蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度。 3. 优点： 1）大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内 2）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低 3）无需除掉多余酸即可进行下一步纯化 4. 缺点： 酸化时，容易引起蛋白质失活 单级萃取 使用一个混合器和一个分离器 单级萃取流程93 （二） 双水相萃取技术 又称水溶液两相分配技术 （partion of two aqueous phase system） 用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）进行萃取。由于形成的两相均有很高的含水量（达70%?90%），故称“双水相”系统。 几种典型的双水相系统 聚丙二醇 聚乙二醇、聚乙烯醇 葡聚糖（Dex） 羟丙基葡聚糖 聚乙二醇（ PEG） 葡聚糖（Dex） 硫酸葡聚糖钠盐 聚丙烯乙二醇 羧基甲基葡聚糖钠盐 甲基纤维素 聚乙二醇（ PEG） 磷酸钾、硫酸铵 硫酸钠、硫酸镁 几种典型的双水相萃取酶蛋白实例 酶 菌 种 相系统 延胡索酸酶 Brevibacterium sp. PEG/ 盐 天冬氨酸酶 E. coli PEG/ 盐 ?-半乳糖苷酶 E. coli PEG/ 盐 亮氨酸脱氢酶 Bacillus sp. PEG/Dex 乙醇脱氢酶 Baker’s yeast PEG/ 盐 青霉素酰化酶 E. coli