第五章 核酸分离纯化.ppt

第五章 核酸的分离纯化;DNA和RNA是生物体中最重要的核酸分子，是分子生物学和分子诊断的研究对象 DNA和RNA的分离纯化是分子生物学研究及分子诊断最基础的工作;核酸分离纯化的原则: 保持核酸一级结构的完整性 尽可能提高核酸制品的纯度;第一节 核酸分离纯化的设计及原则;第一节 核酸分离纯化的设计及原则;一、材料与方法的选择;一、材料与方法的选择;（一） 材料与方法的选择; 1.保持核酸碱基序列的完整性 2.尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度 3.保持核酸的完整性 尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间 尽量避免各种有害因素对核酸的破坏 ;二、技术路线的设计;（一）核酸的释放;; 应该清除的杂质主要包括: 1.非核酸的大分子污染物 蛋白质、多糖及脂类物质等 2.非需要的核酸分子 分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质 3.加入的有机溶剂和某些金属离子;（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤;三、核酸的鉴定与保存;（一）核酸的鉴定; 紫外分光光度法： 核酸分子中的碱基具有共轭双键结构，可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。 ; 各种碱基的紫外吸收光谱; 荧光光度法： 核酸的荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在 UV 激发下发出红色荧光。荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。;EB与DNA的结合 ; 紫外分光光度法： 主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。比值升高或降低均提示制备的核酸纯度不佳。;1.DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA（或RNA） 20μg/ml寡核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0; 荧光光度法： EB等荧光染料示踪的核酸电泳可判定核 酸制品的纯度。;琼脂糖凝胶电泳： 以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳可判定核酸制品的完整性 基因组DNA如果发生降解，电泳图呈拖尾状;DNA的降解; 完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条 带荧光强度应呈特定的比值。 沉降系数大，电泳迁移率低，荧光强度高 沉降系数小，电泳迁移率高，荧光强度低 ; 28S（或23S）RNA的荧光强度一般约为18S（或16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解 若在点样孔附近有着色条带，提示可能存在DNA的污染 ;三、核酸的鉴定与保存;（二）核酸的保存;; 2.RNA的保存;第二节 真核基因组DNA的分离纯化;生物体组织细胞;第二节 真核基因组DNA的分离纯化; 一、酚抽提法; 一、酚抽提法;二、甲酰胺解聚法; 三、玻棒缠绕法;四、其它方法;五、 DNA片段的纯化;五、 DNA片段的纯化;六、 DNA片段的回收;六、 DNA片段的回收;1.二乙基氨基乙基-纤维素膜插片电泳法 2.电泳洗脱法 3.冷冻挤压法 4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法;（二）从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段;第三节 质粒DNA的提取与纯化 ;第三节 质粒DNA的提取与纯化;一、碱裂解法;一、碱裂解法;一、碱裂解法;二、煮沸裂解法;二、煮沸裂解法;三、SDS裂解法;三、SDS裂解法;四、其他方法;四、其它方法;四、其它方法;五、质粒DNA的纯化; 在过量EB存在的条件下，各种不同密度的物质 经离心平衡后得以分开。 蛋白质由于密度小而浮于液面 RNA密度大而沉于管底 各种DNA密度介于蛋白质与RNA之间，处于中部 ;五、质粒DNA的纯化; 不同分子构型的DNA与EB的结合能力不同，密 度下降也不同，因而可将它们有效分离开。 染色体DNA、开环质粒DNA等可嵌入更多的EB，因而密度下降较多 闭环质粒DNA为超螺旋三级结构，EB不易插入而结合量少，密度下降较少 ;五、质粒DNA的纯化;第四节 真核细胞RNA的分离纯化;第四节 真核细胞RNA的分离纯化;一、RNA制备的条件与环境;一、RNA制备的条件与环境; 选择性地使用RNase的变性剂（如酚、氯仿及强烈的胍类变性剂） 使用蛋白酶K 使用阴离子去污剂如SDS、十二烷基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠; 联合使用RNase的特异抑制剂（如RNasin与DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA的降解 加入β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）等还原剂可以还原RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活;二、酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法;二、酸性