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微血管内皮细胞的体外分离培养方法概述＊段慧琴1，张永东2，穆　祥1* (1.北京农学院动科系，北京 102206；2.北京农业职业学院，北京 102442)? 摘　要：微血管内皮细胞在许多病理生理过程中起着关键性的作用。应用体外培养的微血管内皮细胞，不仅广泛应用于微循环系统对不同生理或病理刺激的反应，也可阐明伴随微血管功能障碍和组织损伤的某些疾病的病理机制，所以分离培养动物及人各个器官组织微血管内皮细胞的报道日渐增多。微血管内皮细胞分离方法主要有3种，包括酶消化法、机械分离法和磁珠分离法，每种方法各有利弊。微血管内皮细胞一般通过其表面的血管紧张素酶、摄取乙酰基低密度脂蛋白和表达Ⅷ因子相关抗原进行鉴定。目前从不同组织器官分离培养微血管内皮细胞的方法已经比较成熟。关键词：微血管内皮细胞；体外；分离培养? 从1973年Jaffe E A等成功培养人的脐静脉内皮细胞至今，血管内皮细胞的研究已经取得了重要的进展，极大地丰富了人们对血管内皮细胞的认识。研究资料已经证实，动脉起源的内皮细胞不同于静脉起源的内皮细胞，微血管内皮细胞不同于大血管的内皮细胞[1]，并且不同器官组织起源的血管内皮细胞也表现出不同的功能特性。微血管内皮细胞所表现的组织器官特异性，使人们认识到微血管内皮细胞研究的重要性。因此，研究发生于某一器官或组织的微血管病变，应该采用这一器官或组织的微血管内皮细胞作为细胞模型。因此，微血管内皮细胞的培养技术越来越受到人们的重视，已经成为医学研究中不可缺少的重要手段。但是，由于微血管内皮细胞的培养难度较大，研究成本较高，因而它的普及和应用都受到一定的限制。近年来，内皮细胞生长因子的应用和免疫磁珠技术的发展，使微血管内皮细胞的培养和纯化变得相对简化，加之许多微血管内皮细胞系的建立，使得微血管内皮细胞的研究及应用得到迅速发展。1　微血管内皮细胞体外培养状况到目前为止，人体主要器官和组织的微血管内皮细胞已经培养成功。主要是骨骼肌[2]、心[3-4]、脑[5]、胃[6-8]、视网膜[9]、肺[10]、皮肤[11]、脉络膜[12]和小肠[13]微血管内皮细胞的培养，培养成功的还有脂肪、肝窦、肾、关节滑膜、胎盘、骨髓、胰岛、角膜及食道等器官组织的微血管内皮细胞。这些不同器官和组织微血管内皮细胞的研究，对于认识和了解组织器官内皮细胞的功能特性及对相关疾病的研究提供了有力的工具。国内关于动物源性微血管内皮细胞的培养研究主要集中在大鼠的小肠[14]、肺脏[15]、脑[16]、兔脑[17]和牛视网膜[18]等器官组织。2　微血管内皮细胞分离培养纯化方法2.1　分离方法微血管内皮细胞的分离是将剪碎的组织浸泡在消化酶中，因酶的消化一般是由外向里，所以最后被消化下来的细胞才是内皮细胞。因此，彻底地消化组织是获得足够微血管内皮细胞的前提，且非血管内皮细胞的污染是不可避免的。为了能分离获得足够的微血管内皮细胞，采用过量的酶消化是必要的。一般情况下，应用2 g/L的Ⅰ型或Ⅱ型胶原酶消化20 min～30 min。在某些情况下，需要再采用1 g/L胰蛋白酶/0.1%EDTA溶液进行二次消化，但总消化的时间应控制在30 min以内，以减少微血管内皮细胞的损伤。消化后的组织悬液需要用血清终止酶活性，并将组织悬液通过200目的金属筛去除未消化组织。目前分离内皮细胞的方法主要有3种，即酶消化法、机械分离法和磁珠分离法。几种不同的分离内皮细胞的方法均有优势和局限性，常用的是酶消化法。其优点是分离的细胞多，纯度较高，缺点是酶对某些表面蛋白有破坏作用；后两种方法可以避免酶对内皮细胞的损伤，缺点是其他细胞的污染可能性较大。磁珠分离法是利用特异的介质(表面有内皮细胞特异单克隆抗体的磁珠)从其他细胞群中分离出内皮细胞。这种方法虽然可以分离出可用于炎症研究的微血管内皮细胞，但是分离的细胞量少。机械法一般用于大血管内皮细胞的分离，这种方法避免了酶对内皮细胞的损伤和其他细胞的污染。2.2　细胞的纯化由于在微血管内皮细胞的分离过程中必然伴随非血管内皮细胞的污染，因此微血管内皮细胞的纯化是决定微血管内皮细胞培养成功与否的关键，也是微血管内皮细胞培养的技术难度所在。目前已经建立了多种微血管内皮细胞纯化的方法，并在不同器官和组织微血管内皮细胞的培养中获得成功。在一种微血管内皮细胞的纯化中，往往会在细胞培养的不同阶段，根据细胞的特性、细胞的生长状态和污染的细胞类型采用不同的纯化方法。例如，肠黏膜微血管内皮细胞的培养需要采用局部消化和差速黏附的分离手段得到纯度较高的内皮细胞。在内皮细胞达到局部汇合时应用酶消化纯化血管内皮细胞。一般说来，这些纯化方法各有利弊，在一种细胞的分离中如何选择纯化的方法主要取决于操作者的经验。目前，微血管内皮细胞纯化的方法主要有利用尼龙网或不锈钢网筛过滤细胞悬液、物理刮除法、生长特