醇类沉淀法提取尿液蛋白的优化策略.pdfVIP

· 1534 · 广东医学 2012年6月第33卷第 11期 GuangdongMedicalJournalJun．2012，Vo1．33，No．11 醇类沉淀法提取尿液蛋 白的优化策略水 周慧，雷婷 ，张曼 北京大学第九临床医学院、首都医科大学附属北京世纪坛医院临床检验 中心(北京 1o0038) 【摘要】 目的 研究提取条件，探讨提取尿液蛋白的优化策略。方法 收集健康志愿者的混合尿液标本，采 用甲醇、乙醇、异丙醇沉淀法在不同的条件下提取尿蛋白，这些条件包括 ：醇类试剂的种类、醇类试剂的比例、醇类 试剂与尿液作用的不同温度及作用时间、不同的温度处理程序等。然后测定提取的蛋白浓度，评价蛋白回收量； 十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)评价总蛋白条带；蛋白免疫印迹评价在不同条件下提取的 目的蛋白条带。结果 孵育条件固定为4℃30min时，溶剂为75％乙醇可提取蛋白最多为(649．03±28．33)g； SDS—PAGE和免疫印迹结果显示，在不同醇类溶剂条件下提取的总蛋 白条带和 目的蛋白条带呈趋势变化。提取 试剂条件 固定为75％乙醇时，改变孵育的温度方案，显示先4℃孵育30min后，再 一20℃过夜提取的总蛋白最多 为(599．93±42．20)g；SDS—PAGE和免疫印迹结果都显示，孵育温度方案不同，所提取的总蛋白条带和 目的蛋白 条带无明显差异。结论 75％乙醇，在4~C孵育30rain后，一20℃过夜条件下，可高效提取尿中胰淀粉酶(AMY)， 用于尿AMY定性定量检测。醇类溶剂的比例对提取的总蛋 白量影响很大，且对不同分子量蛋 白有选择性；孵育 温度条件主要影响总蛋 白量。 【关键词】 醇类；沉淀法；尿蛋白；条件优化 尿蛋 白成分，尤其是低丰度蛋白是良好的生物标 1次：男4例，年龄 (25．8±25)岁，女4例，年龄 ( 8± 志物来源 ，在疾病的诊断、监测、预后等方面很有价值 ， 1．5)岁，所有女性标本采集时在非月经周期内。标本收集 有广阔的应用前景 ，但尿蛋 白浓度太低 ，很多手段 于无菌瓶中，1500r／rain离心20min后取上清。 无法检测 ，因此 ，对尿蛋白浓缩是实现临床应用前亟待 1．3 醇类试剂的种类及比例 将2例健康女性与2 解决的关键问题。尿蛋 白提取和浓缩方法主要包括 ： 例健康男性尿标本混合，分成30mL每管。按照尿液 沉淀法 (有机溶剂和盐类)、超速离心法、冻干法、超滤 与醇溶剂体积比3：1、1：1、1：3，分别加入4℃预冷的甲 法等。沉淀法简便易行，且对蛋白浓缩效果较好H，可 醇；同理 ，乙醇、异丙醇均设置相同的3个浓度梯度。 作为比较理想的提取尿蛋 白方法。有机溶剂沉淀法 混匀后置于4℃冰箱30min。12000r／min离心10min 中，乙腈、氯仿等蛋 白回收率低，且在环保和生物安全 后收集沉淀，用适 当体积 的溶解缓冲液混匀溶解， 方面有较高要求；丙酮虽在实验中广泛应用 ，但属 一 20℃过夜，超声裂解 5min。14000r／min离心 20 于易制毒化学品。本研究选择常用的醇类试剂沉淀法 min后取上清。尿蛋 白测定试剂盒检测总蛋 白浓度。 提取尿蛋白，试剂来源方便 ，环境污染小，安全性高 ，在 以上标本处理方法各重复3次，再进行十二烷基磺酸 临床应用方面可行性强。2010年 11月至 2011年 5 钠一聚丙烯酰胺凝胶 电泳 (SDS—PAGE)，上样量 23 月，本实验对醇类沉淀法提取尿蛋 白的具体条件进行 g。Westernblot鉴定尿 AMY提取效果 的差异，上样 了探索，包括醇试剂的种类 、比例、提取的温度、作用时 量23 g，共重复3次。用 1DLANE凝胶分析软件对 间和温度处理程序等，旨在筛选适合 目的蛋 白淀粉酶 Westernblot结果及SDS—PAGE结果中的某些条带进 (AMY)检测的提取方法 ，进而提出醇类沉淀法的优化 行光密度扫描。 策略。 1．4 温度、作用时间及温度处理程序 将3例健康 1 材料与方法