应用2a肽策略构建双基因共表达转基因斑马鱼的研究-四川动物.docVIP

作者张力等：您好！来稿经外审，考虑接收，现请您确认。请注意核对文中拉丁学名是否正确?文中参考文献与文后参考文献列表是否一一对应？参考文献的主要责任者、出版年、文献题名、文献类型、页码等请尽量一一核对无误。若文章无需再修改补充，请在“确认栏”里写明“已经确认，同意此稿在四川动物杂志刊出”后及时返回编辑部，以便进入下一步工序。若还有修改的，请标红并加以简要说明。您的论文已经定稿，根据稿约，文章的署名作者及单位将不再变更或增减。 谢谢支持与合作。对于已经确认的稿件若还有需要修改补充，我们将再次提请确认。故请留意本刊网站上的信息。稿件确认后请关注您预留的电子信箱，用稿通知将直接发到您的邮箱里。谢谢支持与合作。祝好！ 四川动物编辑部 2014-12-22 应用2A肽策略构建双基因共表达转基因斑马鱼的研究( 张力1，刘超1，周昕2，谢英1，刘树锋1* (1. 河北医科大学河北省实验动物重点实验室,?石家庄?050017；2. 华中科技大学同济医学院遗传学系，武汉430032) 摘要：目的 以Tol2为骨架载体，以GFP、Cherry为报告基因，探讨采用“2A”肽双基因载体构建策略构建单启动子双基因共表达质粒的构建方法；将B细胞刺激因子(BAFF)分别置于“2A”序列前后位置，分析位置效应对跨膜融合蛋白的表达与剪切的影响，探讨多基因共表达转基因斑马鱼构建技术。方法 以InFusion法将GFP-2A-Cherry序列构建到Tol2质粒上，所得pTol-GFP-2A-Cherry质粒转染HeLa细胞、显微注射1-细胞期斑马鱼受精卵；倒置荧光显微镜观察HeLa细胞、斑马鱼幼鱼体内GFP与Cherry蛋白的表达，Western blot法验证GFP和Cherry蛋白的表达量与剪切情况；分别构建pTol2-GFP-2A-BAFF与pTol2-BAFF-2A-Cherry质粒，Western blot法检查BAFF的表达与剪切情况。结果 pTol2-GFP-2A-Cherry质粒转染的HeLa细胞，GFP与Cherry均可单独表达且表达呈现时空一致性；GFP-2A-Cherry融合蛋白可被剪切为GFP与Cherry，且成等比例表达趋势。pTol2-GFP-2A-Cherry质粒显微注射1-细胞期斑马鱼受精卵可获得可单独表达GFP与Cherry蛋白的转基因斑马鱼；pTol2-GFP-2A-BAFF与pTol2-BAFF-2A-Cherry于斑马鱼体内均有融合蛋白的表达，且BAFF序列位于2A序列后更易于融合蛋白的剪切。结论 通过2A肽策略构建可实现在斑马鱼体内单一载体、单一启动子调控双基因表达目的。发现编码跨膜分泌蛋白的功能基因位于2A序列的不同位置会直接影响蛋白的剪切，功能基因位于2A序列后易于跨膜蛋白的剪切。 关键词：2A肽; 斑马鱼; 双顺反子 中图分类号： 文献标志码:A 文章编号： The Study on Application of Bicistronic Vector in Transgenic Zebrafish Based on 2A Peptide ZHANG Li1, LIUChao1, ZHOU Xin2, XIE Ying1, LIU Shufeng1* (1. Hebei Key Lab of Laboratory Animal Science, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China; 2. Department?of?Medical?Genetics, Tongji?Medical?College, Huazhong?University?of?Science?and?Technology, Wuhan 430032, China) Abstract: Objective To apply the 2A peptide in generating dicistronic or polycistronic transgenic zebrafish, GFP and Cherry as candidate genes were constructed to the Tol2 plasmid backbone; B cell stimulating factor (BAFF), was also placed upstream and downstream 2A sequence respectively to analysis the position impact on transmembrane fusion protein expression, and explore multi-gene c