page-分析小麦幼苗和根尖过氧化物酶同工酶.docxVIP

分析小麦幼苗和根尖过氧化物酶同工酶实验背景及目的 同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。大多数基因性同工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调节，常表现不同的生理功能。它们存在于生物的同一种属或同一个体的不同发育阶段，或同一发育阶段的不同组织，在细胞发育和代谢调解中起重要作用。在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，体现各组织的特异功能，这一特点可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。品种资源工作者借助同工酶分析品种的地理分布与亲缘关系来指导品种资源的收集与鉴定工作。在医学方面，同工酶是研究癌瘤发生的重要手段。 在本次实验中，我们采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗中的过氧化物酶同工酶。利用电泳现象对过氧化物同工酶进行分离纯化和分析鉴定，通过电泳技术的实际操作体会电泳技术的原理和特点，比较分析电泳技术和其它分离技术如层析技术的不同，进一步学习应用更为广泛和纯化水平更高的分离技术。实验原理本实验由于分离纯化过氧化物酶同工酶为生物大分子，难以用肉眼直接进行谱带的分析和处理，因此需要对电泳谱带进行显色处理。此反应中产生氧自由基，能够与联大茴香胺发生颜色反应，产生褐色的化合物，使条带可见，用于分析过氧化物酶同工酶的分离纯化效果。实验材料及仪器和试剂 实验材料：小麦幼苗； 实验试剂：(1)分离胶缓冲液(pH8.9Tris-HCl缓冲液) （2）分离胶贮存液（分离丙胶）（3）浓缩胶缓冲液（pH6.7Tris-HCl缓冲液）（4）浓缩胶贮存液 （5）TEMED (6)过硫酸铵溶液 （7）10x电极缓冲液（pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液） （8）2%琼脂 （9）40%蔗糖溶液 (10)pH4.7乙酸缓冲液 （11）样品提取液 （12）0.5%溴酚蓝溶液 （13）联大茴香胺染色液 实验仪器：DYY-III2稳压稳流电泳仪一套（北京市六一仪器厂）、烧杯50ml×3，微量进样器（上海安亭微量进样器厂）、大培养皿一套、微量可调手动移液器操作步骤1、电泳槽的安装和凝胶的制备（1）将贮液由冰箱取出，待与室温平衡后再配制工作液。（2）安装电泳槽。安装时，注意旋紧螺丝时要均衡用力，以免夹碎玻璃片。 （3）用2%琼脂封底，以防漏胶。（4）按下表所示配制分离胶 在小烧杯中混匀后，立即灌胶至据短玻璃片顶端2cm左右。立即用滴管在胶的上层小心轻缓地覆盖2~3mm的水层。再次出现界面后，，再静置一会儿，将水倒出，用滤纸条从一侧略微吸浸，注意不要碰毁胶面，准备灌注浓缩胶。贮液名称分离胶缓冲液分离丙胶DH2OTEMED过硫酸铵用量（mL）1.32.76.00．0400.5（5）按下表配制浓缩胶 混匀后立即灌胶，操作同上，至胶面与短玻璃片顶端平齐，立即插入样品槽模板（梳子）。聚合完成贮液名称分离胶缓冲液分离丙胶DH2OTEMED过硫酸铵用量（mL）0.51.02.20.0150.3后，在电泳槽内倒入电极缓冲液，使短玻璃片一侧电极缓冲液没过玻璃片顶端，长玻璃片一侧电极缓冲液没过电极丝，然后小心拔出梳子，准备点样。3、样品的制备（教师完成，已加好溴酚蓝）称取小麦幼苗叶片1g，放入研钵内，加pH8.0样品提取液2ml，于冰浴中研成匀浆，然后以4ml提取液分几次洗入离心管，在高速离心机上以8000rpm离心10min，倒出上清液，以等量40%蔗糖混合，即为样品液1。同上操作，再制备一份小麦幼苗根部的样品液2。4、点样向样品液中滴加1~2滴溴酚蓝作为前沿指示剂，然后用微量进样器梯度上样。每种样品分别上样5μl、15μl、30μl、50μl。5、电泳接好电源线。打开电源开关，调节电流，初始时控制在10mA左右，当前沿进入分离胶后，可调节电流到25mA左右，待前沿指示剂染料下行至据胶板末端0.5~1cm处，即可停止电泳。整个电泳根据稳流电流大小差异，大约需要3~4小时。6、剥胶、染色及记录结果电泳结束之后，将垂直板从电泳槽上取下，小心地将两块玻璃板分开，并小心地将凝胶置于大培养皿中，进行染色。向大培养皿中倒入大约50ml pH4.7乙酸缓冲液，将胶板淹没，室温浸泡10min。倒掉乙酸缓冲液，加入联大茴香胺染色液，将胶板淹没，室温下浸泡至胶板彻底变白，在此期间会出现过氧化物同工酶的谱带，待染色条带充分显色后观察记录酶谱并分析结果。染色过程如下：向培养皿中倒入约50mL pH4.7乙酸缓冲液，将胶板淹没，室温浸泡10分钟，乙酸缓冲液回收至原瓶，可重复使用：加入联大茴香胺染色液，将胶板淹没，室温下至少浸泡20分钟以上，在此期间会出现过氧化物酶同工酶的谱带，最后整块凝胶的背景会呈现白色，观察记录酶谱并分析实验结果。谱带的绘制及结果分析思考题1.电泳凝胶系统由电