阿托伐他汀对人结肠癌裸鼠移植瘤的影响.DOC

阿托伐他汀对人结肠癌裸鼠移植瘤的影响 在世界范围内，大肠癌是位居第四的恶性肿瘤。目前，北京市和上海市大肠癌在恶性肿瘤排名已上升到第 2 位，因此研究大肠癌的防治具有重要意义。他汀类药物的抗肿瘤作用是近年来的研究热点之一，这类药物不仅具有抑制多种肿瘤生长的作用，尚可减少心血管急症的发生率、保护糖尿病患者的内皮细胞功能，从而对肿瘤、冠心病、糖尿病这三种严重威胁人类健康的疾病均有保护作用[1-2]。我们曾对阿托伐他汀对人结肠癌细胞增殖的抑制作用及HSP70表达的变化进行了初步探讨[3]，但肿瘤细胞在体内、体外的生物学行为有所不同，体外实验的结果不代表体内过程。为进一步探讨阿托伐他汀在体内对结肠癌生长的影响，本实验建立了人结肠癌colo-320细胞裸鼠移植瘤模型，观察阿托伐他汀对移植瘤生长的影响，以及HSP70表达水平的变化，为他汀类药物应用于临床提供有价值的理论依据。 1　材料与方法 1. 1　材料　 人结肠癌colo-320细胞株购于中科院上海细胞库，12只(14-16g)雄性BALB/C 裸小鼠购于中科院上海实验动物中心，阿托伐他汀钙标准品由北京红惠公司惠赠，HSP70单克隆抗体购自Santa Cruz公司。S-P免疫组化试剂盒、 DAB显色试剂盒购自北京中杉生物公司。 1. 2　方法　 1.2.1 colo-320细胞悬液的制备　colo-320细胞采用RPMI 1640 完全培养基培养, 含10% 小牛血清。取对数生长期细胞,制成细胞悬液浓度为1×108 /ml 。 1.2.2 动物实验 雄性BALB/C 裸小鼠共12只，计数为1×107的细胞（体积为0.1 ml）接种于裸鼠右前肢腋下，成瘤(移植瘤直径达5mm)后随机分为实验组和对照组，实验组每日经口给予阿托伐他汀,给药量为10mg/kg，对照组每日经口给予PBS，体积均为100μl，喂养4周后处死。剥取移植瘤，天平称重，取少量组织块在10%中性福尔马林中固定，其余组织液氮保存。 大体观察　观察裸鼠的生长变化, 每4天记录裸鼠体重、肿瘤体积。肿瘤体积的计算方法为：V=1/ 2 最大直径×最小直径2，实验结束时测量肿瘤重量，计算肿瘤生长抑制率，肿瘤生长抑制率= (对照组肿瘤体积－治疗组肿瘤体积) ÷对照组肿瘤体积×100 %。 组织学检查　标本经10%甲醛固定, 石蜡包埋, HE 染色, 光镜观察移植瘤组织形态。 免疫组织化学染色法检测HSP70蛋白的表达 取裸鼠肿瘤组织制成石蜡切片，二甲苯脱蜡，微波炉修复抗原，体积分数为0. 3 % H2O2 30 min 去除内过氧化酶，PBS 洗涤，正常血清室温封闭30 min，50μl，PBS代替一抗作阴性对照，4 ℃过夜,其余步骤按试剂盒说明书进行。HSP70表达的评分标准按Koga H 等[4] 方法进行。显色强度分为4级：0=无色，1=浅黄色，2=黄色，3=棕黄色；阳性细胞范围分为5级：0=0%，1=1%~25%，2=26~50%，3=51%~75%，4=76%~100%。每张切片的染色积分以显色强度积分与阳性细胞范围积分的乘积表示。规定积分4分，为(－)；积分≥4分，为（+）。 1.2.6 Western blot法检测HSP70蛋白表达 称取液氮保存的肿瘤组织100mg放入匀浆器,加入150μl蛋白裂解液,匀浆,提取组织蛋白, 用考马氏亮兰法测定蛋白样品浓度，每个样品蛋白上样量为150μg。按常规方法制备 10%分离胶和 4%浓缩胶，每份样本加入变性液煮沸 5 min, 上样每孔内确保加样品的蛋白总量相等, 同时加入 Marker。电泳完毕后转移至硝酸纤维素膜 (PVDF), 用含 5%脱脂奶粉的TBST 液封闭 PVDF 1 h，然后分别加入 1∶200 的一抗(鼠抗人HSP70), 1：400鼠抗人β-actin抗体，室温振荡各1 h, 加入 1∶2000 辣根酶标记二抗（兔抗鼠）, 室温振荡 1 h, 清洗后,将 PVDF 膜放入强化学发光试剂中 1 min, 轻轻摇动, 保鲜膜包裹后, 经 X 光片曝光, 显影定影, 显示特异的蛋白信号。用密度扫描仪分析蛋白产物条带,测定其吸光度值。特异蛋白表达值以(特异蛋白吸光度值/β-actin吸光度值×100%)表示。 1.2.7 统计学处理　所有数据采用SPSS13.0软件包进行统计学分析，采用秩和检验、t检验及 Fishers确切概率法，以α=0.05为显著性水准。 2 结果 2.1 阿托伐他汀对裸鼠体质量的影响 结肠癌细胞接种裸鼠后成瘤率100%。每四天测量裸鼠体重,实验结束时实验组裸鼠的体重增长为6.93±0.75g、对照组裸鼠的体质量增长为6.49±0.54g,两组体质量增长差异无显著性(P0. 05)，表明阿托伐他汀对裸鼠体质量增长