基因差异比较的技术 - 生物在线.doc

基因差异比较的技术mRNA的鉴定，主要方法有Northern 杂交、mRNA差别显示等；二是在翻译水平上对特异蛋白质的鉴定，主要方法有蛋白质的单、双向电泳、免疫沉淀法、酶联免疫吸附法（ELISA）及Western杂交法等。 蛋白质的双向电泳（二维电泳）： 电泳是分析蛋白质及多肽组分最灵敏的方法之一。双向电泳是将等电聚焦IEF和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结合起来，依据蛋白质的等电点和分子量来分辨蛋白质，因此它具有非常高的分辨率。双向电泳技术既能提高多肽的分辨率，又能提供有关多肽的分子量 、氨基酸组成及在某些场合下它们的翻译后修饰作用的信息。等电聚焦分离多肽的技术系以多肽的等电点为基础，因此，可以获得有关蛋白质氨基酸组成的信息。随后在第二向上以分子量为基础进行分离，通常为SDS，极大地促进了多肽定性任务的完成。由于蛋白质双向电泳有以上的特点，就使它按期基因表达和调控的研究中得到广泛的应用，并能用来分离多种类型的蛋白质。 ELISA检测技术 ELISA为酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay）的简称。它是一种利用免疫学原理检测抗原、抗体的技术。它与经典的以同位素标记为基础的液-液抗原-抗体反应体系不同之处是建立了固-液抗原-抗体反应体系，并采用酶标记，抗体与抗原的结合通过酶反应的放大作用，使测定的灵敏度极高，可检测出1pg的目的物，同时酶反应还具有很强的特异性，因此ELISA是研究基因表达的十分有效的方法。除了可溶性抗原（抗体）外，ELISA还可以检测含表面抗原的细胞。ELISA检测程序分三个阶段：抗体的制备；抗体或抗原的包被；免疫反应及检出。其中酶-抗体偶联物的制备是ELISA的基础。酶与抗原特异性抗体偶联后，可通过ELISA或免疫印迹反应来检测抗原。 ELISA使用的酶应具有特异性强、纯度及比活高、室温下稳定、来源方便、价格便宜等优点。目前主要使用辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AKP）。 报告基因的使用 在植物基因工程学中，对研究的特定基因是否在植物细胞表达，可以用特殊的报告基因连接到目的基因上，该报告基因可以和目的基因一起转录和翻译。利用报告基因随着环境因素变化的表达性质研究植物分子生物学是极其普遍的。在植物中常用的报告基因有： 1．大肠杆菌的α-葡萄糖苷酸酶（GUS）： 它相当于在微生物及动物系统中使用的β-半乳糖苷酶，只是其作用底物为葡萄糖苷酸。该酶在脊椎动物和微生物中表达，植物细胞中几乎不表达。当GUS基因转入植物细胞内表达时，若与X－葡萄糖苷酸酶（X-gluc，与X-gal相似），保温后，就会产生蓝色反应，借此可以得知报告基因的表达程度，但是该酶不能分泌在细胞外，因此在测定酶活时，须将细胞杀死，破碎。 2．昆虫的荧光素酶基因：植物活细胞基因表达的检测可用昆虫的荧光素酶基因作为报告基因，其工作原理如下：将昆虫荧光素和ATP表达荧光素酶的植物细胞混合，该酶催化昆虫荧光素的氧化反应，并生成AMP、CO2和光，表达该酶的植物细胞或组织便可用感光胶片检测。例如，叶子的表面用砂纸磨损然后注入含有昆虫荧光素和ATP的缓冲液中，晾干，将X－光胶片覆盖在叶子上，则表达昆虫荧光素酶的细胞就会使胶片感光与同位素检测方法一样。 蛋白质芯片 蛋白质芯片以蛋白质代替DNA作为检测目的物，比基因芯片更进一步的接近生命活动的物质层面，因而有着比基因芯片更加直接的应用前景。蛋白质芯片：将“诱饵”蛋白（通常是抗体）固定在经特殊处理的表面上，检测样品“猎物”。只有那些与特定抗体特异结合的蛋白留在里芯片上。蛋白质芯片技术实际上是ELISA酶联免疫吸附技术的大规模应用。它的独特之处在于，选择合适的单克隆抗体，可以将不同翻译后修饰的蛋白质区分开来。 不同于DNA和RNA分析，利用生物芯片进行蛋白质功能的研究仍有许多困难需要克服，其中一个难点就是由于许多蛋白质间的相互作用是发生在折叠的具有三维结构的多肽表面，不像核酸杂交反应只发生在线性序列间。芯片分析中对折叠蛋白质的需要仍难达到，有以下几个原因：第一，芯片制备中所用的方法必需仍能保持蛋白质灵敏的折叠性质，而芯片制备中所有的化学试剂、热处理、干燥等均将影响到芯片上蛋白质的性质；第二，折叠蛋白质间的相互作用对序列的依赖性更要强，序列依赖性使得反应动力学和分析定量复杂化；第三，高质量的荧光标记蛋白质探针的制备仍待进一步研究。这些原因加上其它的问题减慢了蛋白质芯片检测技术的研究。 噬菌体全套抗体库技术 噬菌体表面全套抗体库技术（phage display antibody repertoire library technique）是将全套抗体基因克隆入噬菌体表达载体，使全套抗体分子片段被呈现表达于噬菌体蛋白质Ⅳ上。用全套抗体库筛选差异蛋白质时，先用目的细胞对噬菌体表