协作项目技术平台操作规范实用手则.doc

863协作项目技术平台规范实用手则 ——白血病分子分型和个性化治疗协作组 白血病等血液系统恶性疾病标本收集的操作规程--------------------------------------2 骨髓标本采集、RNA/DNA抽提、cDNA合成---------------------------------------------------5 定性RT-PCR检测白血病常见融合基因的操作规程-------------------------------------7 实时定量PCR检测白血病常见融合基因的操作规程-----------------------------------10 PCR测序检测白血病常见基因突变的操作规程-----------------------------------------12 PCR检测T-ALL患者NOTCH1基因突变-------------------------------------------------12 PCR检测白血病患者FLT3基因突变----------------------------------------------------14 PCR检测AML（M3除外）患者NPM基因突变-----------------------------------------14 PCR检测骨髓增殖性疾病白血病等血液系统恶性疾病标本收集 骨髓标本采集 要求白血病等血液系统恶性疾病于疾病初发、初诊；治疗缓解；随访（6个月、1年、2年、5年）及复发等四个时间点无菌采集骨髓标本3-5ml x 3管。 第一管： 5ml骨髓标本收集于无菌染色体培养管（内含78%RPMI1640培养液，20%小牛血清，0.2%肝素，1%青链霉素及1%谷氨酰胺）。经初步细胞计数后，分装8x106细胞用于培养及进行核型与FISH分析；分装5x106细胞用于抽提RNA进行融合基因检测；所余细胞争取冻存5x106~107 x1管于液氮，以备将来复苏。 第二管： 2-3ml骨髓标本收集于无菌肝素抗凝管，用于进行流式细胞学免疫分型。 第三管： 5ml骨髓标本收集于无菌EDTA抗凝管，用于科研标本收集。经初步细胞计数后，分装1~3x106 x2管细胞于-80℃以备抽提RNA；分装1x105 x2管细胞于-80℃以备抽提DNA；所余细胞争取冻存5x106~107 x1~3管于液氮，以备将来其他科研用途。 二、骨髓细胞冻存 （一）液氮细胞冻存（以备将来复苏及其他科研用途） 分离单个核细胞：将骨髓或外周血标本轻轻加至Ficoll淋巴细胞分离液（上海华精生物高科技有限公司）上（标本与Ficoll体积比为2：1），2000rpm离心20min。 小心吸取位于上清液和下层Ficoll之间的单个核细胞层，加入RPMI1640 6ml，混匀，1000rpm离心10min。 弃上清，用RPMI1640再洗涤一遍。 弃上清，每5-10×106/ml细胞加1ml小牛血清，充分混匀。 于冻存管上标示好标本采集日期，患者姓名，冷冻号，标本来源及细胞数。 将细胞小牛血清混悬液分至冻存管内，每管1ml，置于冰浴中，边摇边慢慢滴入等量预冷的20%DMSO（用RPMI1640配置），混匀。 用程序降温仪将冻存管℃，再放入液氮长期储存存管置于4℃10分钟→-20℃30分钟→-80℃16-18小时（或隔夜）→液氮长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。放入-80℃冰箱中。 KHCO×××××××××××g NH4Cl 8.3g EDTA-Na×××××××××××mg（或加入10ml 0.37% EDTA-Na2溶液） 加水至1000ml（pH 7.2～7.4） 2．生理盐水 ( 0.9% NaCl) （二）操作步骤 1．骨髓1-2ml加入红细胞裂解液10ml，混匀，室温放置3分钟，室温2000rpm离心3分钟。 2．去上清，沉淀加入红细胞裂解液10ml，吹打使细胞重悬，室温放置3分钟。 3．室温2000rpm离心3分钟。 4．去上清，沉淀加入生理盐水10ml，吹打使细胞重悬。 5．室温2000rpm离心3分钟。 6．去上清，加入少量的生理盐水，吹打使细胞重悬。 7．分装为若干管，每管细胞数约5~10×106。 8．-80℃冻存。 四、急性白血病人药物代谢组学取样规程 尿样： 分别于病人入院用药前1天、用药后第1、3、7天及出院前一天，用1000mL量杯取全部清晨第一次尿液，分别记录尿液总体积，混匀后分别吸取5mL置三支10mL塑料离心管密封，记录标号，立即于－80℃冰箱冷冻保存，运输时统一采用干冰盒(干冰袋置于保温盒中