杂色曲霉素对小鼠室周器官及其它脑区影响及其机制的研究.pdf

中文摘要 杂色曲霉素对小鼠室周器官及其它脑区的影响 及其机制的研究 摘 要 目的：霉菌毒素对脑组织的损伤受到了国内外许多学者的广泛关注， 报道。室周器官(circumventricular 器官，包括穹隆下器、正中隆起、终板血管器、脉络丛、连合下器、松果 体后叶及最后区等，由于其缺乏血脑屏障，因此是监控血成分的理想位点。 本实验通过灌胃给药构建ST动物实验模型，研究给药后不同时间点ST 对CVOs生物学效应。观察给药后小鼠穹隆下器、脉络丛和外侧隐窝形态 学变化及其室管膜和室管膜下细胞超微结构变化。检测小鼠穹隆下器、脉 络丛和外侧隐窝n师一仅、TGF．p2基因的表达情况。检测小鼠穹隆下器、 脉络丛和外侧隐窝和其他脑区细胞凋亡，探讨ST对脑组织的影响及其机 制。其意义在于首次研究ST毒素对CVOs的作用，为以后更加深入了解 ST毒素对脑组织的影响奠定了一定的基础，同时为研究其他毒素对脑组 织的影响开辟了一条新的途径。 方法： 1扫描电镜和透射电镜检查 雄性BALB／c小鼠，体重18～20 g，由河北医科大学实验动物部提供。 将1 3000 ml生理 组1组，处理组按ST p眺g(sigma公司)的剂量，溶于O．5 盐水中灌胃。对照组1组用等量的生理盐水灌胃。灌胃后即刻处死动物， 处理组动物于灌胃后1、2、4、8、16h处死动物。 1．1扫描电镜标本制备 麻醉动物后，开胸经心脏常规灌注，灌注液为1．5％多聚甲醛和2．5％ 戊二醛磷酸缓冲液(O．1 mol／L，pH7．2)。灌注完毕取出整脑，在固定剂中 (4℃)后固定12 h。将修好的脑组织块用磷酸缓冲液(O．1m01／L，pH7．2) 仔细冲洗3次，再放入磷酸缓冲液中过夜，梯度酒精脱水，叔丁醇置换， 二氧化碳临界点干燥，真空喷金，日立S．3500N扫描电镜观察、照像。 中文摘要 1．2透射电镜标本制备 麻醉和灌注方法同扫描电镜制备，灌毕取出整脑，并经正中线切开， 放置在含4％戊二醛的磷酸缓冲液中后固定12 h。移去小脑，暴露第四脑 室底和外侧隐窝，剔除多余的脑组织，经1％的锇酸后固定2h，常规透射 电镜处理，光镜下定位后再行超薄切片，醋酸铀、枸橼酸铅电子染色，日 立H．500透射电镜观察、照像。 2 TNF．Q和TGF．p2原位杂交标本制备和杂交步骤 2．2 TNF．仅和TGF．睁2原位杂交标本制备 雄性BALB／c小鼠36只，对照组和处理组各18只，随机分组，每组 3只，对照组和处理组动物分别于灌胃后O．5、1、2+、4、8、16h处 000 死动物。麻醉后，开胸经心脏常规灌注含有1／1 Erasal(深圳华氏生物 成后取脑，后固定，常规脱水、浸蜡、包埋。用Leica切片机进行连续切 片，切片厚度6岬。 2．3 TNF．晓和TGF．p2原位杂交基本步骤 石蜡切片常规脱蜡，3％H202灭活，胃蛋白酶消化，预杂交4h，杂交 12h， SSC冲洗，加封闭液封闭，之后依次加抗地高辛抗体、SABC进 行反应，DAB显色，苏木素轻度复染，脱水、透明，照片。 3细胞凋亡标本制备及杂交步骤 3．1 细胞凋亡标本制备(同耵师．O【和TGF．p2原位杂交标本制备) 3．2细胞凋亡检测 O．01M 缓冲液混合液标记2h，清洗后，加封闭液封闭，之后依次加抗地高辛抗 体、SABC进行反应，DAB显色，苏木素轻度复染，脱水、透明，照片。 结果： 1扫描电镜结果 h后，部分SFO室管膜表面微绒毛 扫描电镜结果显示单次ST灌胃1 结构消失、细胞破损，灌胃后2h室管膜出现凹凸不平、损伤加重，灌胃 后8h室管膜凹凸不平和破损最为明显，ST灌胃后16h逐