小鼠胚泡着床期子宫内膜LongSAGE基因文库构建-中国细胞生物学.PDF

细胞生物学杂志 Chinese Journal of Cell Biology 2006 , 28: 463-467 小鼠胚泡着床期子宫内膜LongSAGE 基因文库构建 徐以民何俊琳刘学庆刘孝云陈雪梅王应雄* (重庆医科大学公共卫生学院选传优生教研室，重庆 400016) 摘要 按照 LongSAGE 文库构建原理，先后经子宫内膜总RNA提取、 cDNA合成、 130bp 双标签的产生、 PCR 扩增、 34 bp 双标签形成、连接成串联体、与载体连接、转化大肠杆菌等相 关步骤构建小鼠胚泡着床期子宫内膜 LongSAGE 基因之库。经证实所构建文库的阳性克隆率达 100% ，克隆中插入的串联体长度介于400-500 bp 之间，成功构建了小鼠胚泡着床期子宫内膜 LongSAGE基因文库。 关键词 小鼠:子宫内膜:着床; LongSAGE 文库 胚泡着床是建立娃振的关键环节，其间涉及子 基因文库，并用PCR 法对该文库质量进行鉴定，为 宫内膜容受态的建立、胚j包与子宫内膜上皮细胞的 进-步筛选与着床有关的相关基因打 F基础。 相互识另IJ 、定位及教附，进而穿透子宫内膜表面， 植入子宫内膜基质中，完成着床过程。长期以来， 1 材料与方法 胚泡着床机制的研究♂直是生殖医学领域研究的难 1. 1 小鼠子宫内膜总RNA 的提取和 130 bp 双标 点和热点之一。由于胚泡着床的细胞生物学与分子 签(ditag)制备 生物学机制十分复杂，至今对其尚未完全阐明。人 一级 NIH 小鼠， 6-8 周龄，由重庆医科大学 们以往」直试图从某些特定的分子与基因作为突破 动物中心提供。选择动情周期中任意时期的未交配 U ，探寻着床发生机制，并发现着床期间特定分子 雌鼠于晚上8 点与雄鼠(2 : 1) 合笼，次晨发现有阴 与基因的表达随时相的不同而发生明显变化。但目 栓者作为娃振第 1 天(记为 d ) 。耳又饪振第 5 天雌鼠， 1 前国内外尚无着床期子宫内膜基因表达变化规律的 经尾静脉注射0.125 m1 0.5% 台盼蓝， 10 min 后脱 相关报道。人们发现，只有处在一定发育阶段的胚 颈处死， 75% 乙醇消毒，解剖取出着色子宫角(证 泡与特定功能状态下的子宫内膜相接触，才能看床， 明己着床，着色部位为着床位点)，冷PBS 冲洗宫 这个特定阶段称为着床窗(imp1antation window) 。因 腔， f~u 置显微镜(Olympus IMF-2)下计数冲洗掉的胚 此，探索着床期子宫内膜基因表达变化对阐明着床 泡数(胚泡数应与着床位点数.3)，以确保胚泡去 的分子机制尤为重要。 除，并迅速用机械法剥离整个子宫内膜。 LongSAGE 是目前最新的基因表达系列分析 采用 TRIzo1@ 试剂(Invitrogen) --步法提取总 (seria1 ana1ysis of gene expression , SAG