PPARγ激动剂对增生性瘢痕成纤维细胞TGF-β1及Smad信号途径作用探究.docVIP

PPARγ激动剂对增生性瘢痕成纤维细胞TGF-β1及Smad信号途径作用探究增生性瘢痕是以成纤维细胞过度增殖和细胞外基质过度沉积为主要特征的结缔组织疾病。其发病机制至今尚未彻底阐明。目前已知,转化生长因子(TGF)β1是主要致纤维化因子之一, Smad是参与TGF-β主要信号转导途径, Smad2和Smad3磷酸化参与其信号转导。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)系一类配体激活的核转录因子超家族,受到配体或激动剂的激活而活化,参与许多细胞功能的调控[1-3]目前有关其对瘢痕成纤维细胞作用机制的研究尚少。本文通过研究PPARγ激动剂对TGF-β1致瘢痕成纤维细胞作用的影响及机制,初步探讨PPARγ激动剂抗瘢痕形成的潜在作用。 1材料和方法 1.1 材料 1.1.1 取材标准：①增生性瘢痕，瘢痕色泽红，质硬，高出皮肤表面，均为烧伤创面愈合已超过3个月，但瘢痕仍持续增生，瘢痕局部无感染和溃疡，均未曾治疗；②患者无其他疾病。 1.1.2 增生性瘢痕成纤维细胞：采用组织块法进行原代培养，将手术中切下的符合条件的增生性瘢痕在无菌条件下切除其表皮，在少量胎牛血清中将标本切成1mm左右的组织块置于培养瓶中，在95%空气、5%CO2、37℃、饱和湿度条件下培养6～8h，使组织块牢固的粘附在瓶壁上，然后加入含10%胎牛血清的DMEM培养基适量，继续培养，3～4天换液1次，2～3周后，原代细胞生长成单层，用0.25%胰蛋白酶消化后，按1:3的比例传代培养，实验用第3～5代细胞。 1.1.3 主要试剂:DMEM细胞培养液和胰蛋白酶(美国GIBCO公司),人类重组TGF-β1(美国Pepro Tech EC Ltd公司), PPARγ配体15d-PGJ2、曲格列酮和齐格列酮(美国Biomol公司),Trizol提取液(美国GIBCO/BRL公司),逆转录试剂盒(立陶宛Fermentas公司),山羊抗大鼠Smad2、Smad3、磷酸化Smad2/3(P-Smad2/3)多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，兔抗大鼠FN多克隆抗体(美国GIBCO公司),辣根过氧化物酶标记IgG二抗(美国KPL公司),PCR引物(上海生工合成)。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养与刺激: 第3～5代细胞瘢痕成纤维细胞株培养于含10%灭活小牛血清的DMEM/F12培养液中,置37℃, 5% CO2培养箱中,按1×106接种于25cm2培养瓶中,待细胞生长至80%融合状态,无血清DMEM/F12培养液孵育24h,使细胞生长同步化。分别加入不同浓度的TGF-β1(0、1、2、5和10ng/ml)培养24 h,或加入5ng/ml TGF-β1分别培养0、6、12和24h后收集细胞。同法进行细胞培养,分别应用10μmol/L 15d-PGJ2、10μmol/L曲格列酮、10μmol/L齐格列酮预处理2h,再加入5ng/ml TGF-β1处理,另设一空白对照组和5ng/ml TGF-β1组,作用24 h后收集细胞。对照组和各处理组均重复3次。 1.2.2 RT-PCR检测瘢痕成纤维细胞细胞FN mRNA的表达:以Trizol法提取上述收获的细胞总RNA,按逆转录试剂盒操作说明将RNA逆转录为cDNA,进行PCR扩增。FN上游引物: 5’TTATGACGATGGGAAGACCTA3’;下游引物: 5’GTGGGGCTGG AAAGATTACTC3’;β-肌动蛋白上游引物: 5’TGGAGAAGAGCTAT GAGCTGCCTG3’;下游引物: 5’GTGCCACCAGACAGCACTGTGTTG3’。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,用计算机凝胶成像分析系统进行吸光度扫描分析,以β-肌动蛋白吸光度值(A)进行校正。 1.2.3 Western印迹检测瘢痕成纤维细胞细胞FN蛋白的表达:刺激细胞结束时,加细胞裂解液,4℃, 12 000r/min离心10min,上清液中的蛋白浓度以二喹啉甲酸(BCA)法测定。取等量蛋白与5×上样缓冲液混合煮沸5 min后进行凝胶电泳。电泳后进行Western印迹检测FN蛋白表达。 1.2.4 Western印迹检测瘢痕成纤维细胞细胞Smad及酸化Smad蛋白:同上方法培养细胞,以1×105接于六孔板中,加入5 ng/ml TGF-β1分别培养0、1min、30min、1h和2h后收获细胞,提取总蛋白,处理分组:对照组, 2ng/ml TGF-β1组, 5ng/ml TGF-β1组, 10μmol/L 15d-PGJ2＋5ng/ml TGF-β1组, 10μmol/L曲格列酮＋ng/ml TGF-β1组, 10μmol/L齐格列酮＋5 ng/ml TGF-β1组(3种药物分别预处