关于小鼠子宫中PTP及MKPE2转换反应以及IGF-I路径主要成分下调暂时研究.doc

关于小鼠子宫中PTP及MKPE2转换反应以及IGF-I路径主要成分下调暂时研究资料和方法? 动物和处理方法：10周大的雌鼠C57BL6，给予3周的时间以适应环境。单独养在一个可控环境温室中（温度22±3℃；湿度50±20%；12小时光暗交替，早上7点15开灯）。小鼠可以自由饮食。? 试验动物重量20～24g，14只动物根据重量随机分成六组：第一组，性腺切除术（GDX）控制；第二到第六组，GDX+17β雌二醇（E2：0.05μg/小鼠）。研究的第1天，小鼠在麻醉下被切除卵巢（GDX）。在第8天作尸检之前，小鼠被单独皮下注射（0.2ml/小鼠）5%乙醇-0.4甲基纤维素（第一组）或者E2（第二组到第六组）。第一组在尸检前24小时注射。E2的注射分别在尸检1小时前（第二组），3小时前（第三组），6小时前（第四组），12小时前（第五组），24小时前（第六组）。? 研究的第8天，小鼠在麻醉下从腹部大动脉放血，移除子宫颈。子宫被迅速冷冻在液氮中。组织保存在-80℃的环境中直到RNA被提取。根据对待方案，用低核苷酸微观排列分析法分析12 000组基因的临时mRNA变化（MG-U74 v2）。? RNA离析和微观排列杂交及分析：总的RNA根据制造商协议用Trizol法分离，总的RNA通过孵化400U上标ⅡRT，用一个 T7-oligo-d(T)24 primer 5’-GGCCAG-TGAATT-GTAATA-CGACTC- ACTATA -GGGAG-GCGG- (dT)24-3’，1x 一级缓冲液(50 mM TrisHCl，pH8.3，75mM KCl，3mM MgCl2，10mM DTT)，和 0.5mM dNTPs 在42℃运转一个小时转换为cDNA。二级合成是通过40U的DNA聚化酶Ⅰ，埃希氏菌属大肠杆菌DNA链接酶，2U核糖核酸酶H，1x反作用缓冲液［18.8mM TrisHCl，pH8.3，90.6mM KCl，4.6mM MgCl2，3.8mM DTT，0.15mM NAD，10mM(NH4)2SO4］，和0.2mM dNTPs在16℃运作2小时。? 聚类分析：基因在一个以上的生物过程中进行分类，因为许多蛋白质能反映许多不同的细胞新陈代谢中的生理活动，而这些生理活动更能说明基因机能的代表性。? Q-RT-PCR：复制样本中的总的RNA中相当于20ng的cDNA，在活的有机体内通过光循环实时PCR设备，被用来进行荧光基础实时PCR量化。? 结果? 微观排列分析：子宫到雌二醇的通常反应。被E2上调的736组基因中，有4种基因表达：基因簇A(19%，139/736)3小时内起反应，基因簇B(37%，274/736)6小时内，基因簇C(26%，188/736)12小时内，基因簇D(18%，135/736)24小时内。下调基因的表现中(基因簇E，F，G)，能量代谢是基因簇E下调中的主要生物过程，基因簇F，与基因簇E相比，在信号转换，转移和蛋白质代谢中的基因扩增的表现为细微的减少。? 特定前期基因调整：0～6小时(基因簇A，B，E)。基因相关的信号转换主要观测基因簇A，特别是那些属于蛋白激酶层叠，MAPKK层叠，mRNA分解代谢，分别证明了层叠扩大数3.6，5.7和11.1。? 特定后期基因调整：6～24小时(基因簇C，D，F和G)：蛋白新陈代谢中的传输分子和基因占了基因簇C中的大部分，特别是基因相关的细胞内传输(3.6-褶皱)，细胞定位(3.5-褶皱)，蛋白质确定对象(5.5-褶皱)，肌动球蛋白组织结构和生物源(29.9-褶皱)。在基因簇D中，与细胞粘附、发展，和能量代谢相关的基因过度表达。? 雌二醇调节IGF-I路径：为了确认IGF-I路径中一些基因的基因表现的临时改变，执行Q-RT-PCR。简要地说，分析了六组IGF相关基因，三组Ras/Raf/MAPK路径相关基因，三组PIK3路径相关基因，五组酪氨酸和MAP激酶磷酸酯基因。所有基因测试在微观排列和Q-RT-PCR之间显示了82%的相关率。? IGF相关基因：当今研究中，IGF-I基因在12小时内起反应。有趣的是，它的感受体，IGF-IR，在6小时内下调。IGFBP2和-6的表现在12小时内分别是增加和减少。? Ras/Raf/MAPK路径：Cdc25c基因表现在6到24小时内明显增加。? PI3K路径：GAB1和 PIK3R2的基因表达在6小时内减少。编码为恩多菲林细胞死亡促进者的SH3领域GRB2样B1基因(SH3GLB1)，首先在3小时内细微上调，然后在6～12小时之间反应缓慢。BCL2样11基因也在12小时内下调。PIK3路径的IGF-I活化促进了反减弱影响。? 酪氨酸和MAP激