培养兔角膜缘干细胞自体移植治疗眼表碱烧伤探究.docVIP

培养兔角膜缘干细胞自体移植治疗眼表碱烧伤探究基金项目 2006年度宁夏自治区教育厅资助项目（W200634）? 摘 要 目的：探讨培养兔角膜缘干细胞，自体移值治疗眼表碱烧伤的可行性。方法：体外培养兔角膜缘干细胞，传代于去上皮羊膜，自体移植治疗眼表碱烧伤；术后应用裂隙灯观察、免疫组化、透视电镜等方法，与单纯羊膜移植组疗效进行对比。结果：体外培养细胞既有角膜上皮特性，又具有强的增殖潜力。培养细胞移植组术后角膜上皮完整，炎症化、血管化减轻，与单纯羊膜移植组各项指标差异有显著性意义。结论：培养角膜缘干细胞移植术可有效重建眼表。? 关键词 细胞培养 羊膜 碱烧伤? 资料与方法? 实验动物：健康新西兰大白兔24只，体重2.0~2.5kg，雌雄兼有，完全随机分为两组，培养角膜缘干细胞移植组12只，单纯羊膜移植组12只。? 羊膜准备：健康剖宫产孕妇取羊膜，用含青链、庆大、两性霉素的平衡盐溶液反复冲洗，剪成10cm×10cm大小，平铺于纤维膜上，培养液和甘油混合液-20℃保存1个月。取1块羊膜培养，检测无菌后使用。复水30分钟，单纯羊膜移植组直接应用，去上皮羊膜培养组加入胰蛋白酶EDTA液37℃消化20分钟，刮除全部羊膜上皮细胞，修剪成4cm×4cm大小，钻掉35mm培养皿的底，将剪好的羊膜包于其上，缝线固定。? 细胞培养：DMEM和HamsF12混合增养基（1∶1），胎牛血清20%，加入表皮生长因子、谷氨酰胺、胰岛素、青链霉素等，pH7.2~7.4。取1cm角膜缘组织，0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合液（1∶1）37℃消化10分钟，重悬细胞及组织块共同移入培养基，37℃，0.05CO2培养， 隔日换液，接种后4天祛除组织块，至对数生长期传代，按5×104个/ml接种于33mm培养皿培养中，羊膜上皮面对应传代细胞层，基底面对应含3T3成纤维细胞的66mm培养皿，加入培养液使羊膜片处于气-液界面水平，37℃，0.05CO2培养，隔日换液，细胞至对数生长期，AE5细胞免疫鉴定后移植。? 动物模型制作、鉴定及手术治疗：完全随机选取1眼，环形剪开结膜，将浸透1mol/L氢氧化钠溶液的滤纸环片（内径8mm,外径14mm）置于兔角膜缘，玻璃棒轻压30秒，生理盐水彻底冲洗。烧伤后10天行印迹细胞学检查，模型建立成功者行移植手术。彻底清除坏死组织，羊膜上皮面向下10.0尼龙线间断缝合固定于浅层巩膜，结膜下注射抗生素。每日妥布霉素眼液5次，眼膏1次。? 术后检查：10、20天行裂隙灯检查，21天空气栓塞处死动物，1/2角膜AE5单克隆抗体免疫组化检查，1/2透视电镜检查。? 统计学处理：采用列联表资料卡方检验，以P0.05为差异有显著性。? 结果? 细胞增养：接种24小时见细胞贴壁，组织块边缘出现典型的“沙滩状”移行带，培养7天细胞达80%汇合状态；去上皮羊膜上传代细胞3天开始成片生长，7天基本汇合成单层，15天整个羊膜覆盖排列致密的复层细胞；复层细胞AE5免疫鉴定呈强阳性，表层细胞扁平，基底细胞呈柱状，与正常角膜上皮结构相似。? 动物模型：烧伤眼上下角膜缘区均可见大量PAS染色阳性的杯状结膜上皮细胞，原来存在的多角形或圆形PAS染色阴性的角膜上皮细胞已很少见，提示该处角膜上皮已结膜化，说明已制成角膜缘干细胞严重缺乏兔模型。? 大体检查：①培养移植组：角膜透明度增加，新生血管较少，角膜上皮荧光染色阴性。②羊膜移植组：角膜混浊水肿略好转，四周均见新生血管，结膜上皮覆盖角膜缘及部分角膜，荧光染色大部分呈阳性。③列联表资料卡方检验：角膜混浊，X2=19．200；角膜新生血管，X2=12．571；荧光素角膜染色，X2=24．000；角膜结膜化，X2=24．000；各组P0．05，两组间差异均有显著性。? AE5免疫学检查：①培养移植组：羊膜大部分溶解，其下见排列整齐的复层柱状或扁平状角膜上皮细胞，AE5染色阳性，偶见炎性细胞，未见杯状细胞和新生血管。②羊膜移植组：羊膜变薄、脱落，角膜上皮仅见1~2层细胞，排列不整，周边部见杯状结膜细胞，AE5染色阴性，基质屋胶原纤维排列紊乱，炎性细胞浸润，新生血管较多。? 透视电镜检查：①培养移植组：角膜全层轻度增厚，未溶解羊膜与角膜连接紧密，角膜上皮细胞呈复层，立体感强，细胞器丰富，细胞之间可见桥粒连接和镶嵌连接，基底膜完整，角膜基质层胶原纤维排列整齐。②羊膜移植组：角膜厚薄不均，上皮层缺如，仅见1~2层细胞，胞质空泡样改变，细胞溶解，基底膜欠完整，基质层变薄，成纤维细胞坏死、少量新生血管，炎性细胞侵入。? 讨论? 动物模型：印迹细胞学检查具有创伤小，快速、简便、易行，检验部位自由、全面等优点。严重眼表碱烧伤，角膜缘干细胞严